利用不连续Percoll-蔗糖密度梯度制备小鼠皮层突触体神经元组分
2011年9月17日
本文介绍了一种从小鼠脑皮层制备具有翻译活性且结构完整的突触体（SNs）的方法。该方法采用不连续的Percoll-蔗糖密度梯度，可快速制备出具有活性的突触体。
本实验的总体目标是利用不连续的蔗糖密度梯度，从小鼠脑皮层制备具有翻译活性的突触体。首先收集并匀浆小鼠脑皮层组织，然后对匀浆液进行离心。随后，将离心后的匀浆液或上清液加样至预先配制的蔗糖密度梯度中。
最后一步是离心并收集突触体组分。最终的蛋白质印迹分析和S35-甲硫氨酸掺入实验表明，该突触体组分富含突触成分且具有翻译活性。与现有的离心和过滤方法相比，该技术的主要优势在于：第一，通过使用密度梯度避免了机械损伤；第二，该方法对细胞及其组分的毒性较低。
通常，初次接触该方法的研究人员会在此实验方案上遇到困难，因为时间控制起着关键作用。一旦收获肾上腺皮质后，应迅速完成后续操作。开始实验前，通过将相应体积的SIP按照随附文稿中的说明加入GM缓冲液中，配制3%、10%、15%和23%的梯度层，并充分混匀。
使用移液器将23、15、10和3%等渗Percoll溶液每种各2毫升加入带盖的Beckman离心管中，以形成梯度层。使用P1000移液器时，各层之间的界面应清晰可辨，且各层之间不得混合。梯度液在使用前需在4°C下保存至少20分钟。
开始此操作前，按照随附的手稿描述准备好其他必要的溶液。对 P13 至 P21 日龄的小鼠实施安乐死，并用 70% 乙醇喷洒其颈部背面和头部，以准备解剖。然后使用一把锋利的剪刀在颅底处剪断脊髓。
接着，去除颅骨顶部的皮肤。在顶骨与间顶骨之间，或大脑与皮层区域之间，沿颅骨侧向剪开。然后，沿矢状缝从颅底向鼻部方向剪开颅骨。
在此步骤中，小心地将两侧半球向旁边拉开，以去除柔软的顶骨。随后，将解剖刀插入小脑上方的脑组织中，挖出大脑皮层。将其放入冰冻的GM缓冲液中，并重复上述操作以收集更多的皮层组织。
现在用冰冻的GM缓冲液冲洗皮层。然后将两个皮层转移至含有5 mL冷GM缓冲液的玻璃Dounce匀浆器中。先用A型研杵（松研杵）轻轻匀浆5到10次，接着用B型研杵（紧研杵）再匀浆5到10次。
strokes 的数量因不同的匀浆器而异。将匀浆液转移至 15 毫升的锥形管中。以 1000 × g 离心。
在Allegra six KR离心机中，4摄氏度下以重力离心10分钟，沉淀细胞碎片和细胞核。将上清液取出，每管加入2毫升，用于每个per或蔗糖梯度，每个完整皮层对应一个梯度，并封口试管。然后在Beckman J 2 21离心机中，使用固定角转子，4摄氏度下以32,500 ×g离心5分钟。
完成操作后，使用合适的接头，梯度应产生一条明显的SN条带，用移液器吸去并弃去SN条带上方的溶液。使用玻璃巴斯德移液器在15%至23%界面处吸取SN条带，通常一个梯度可获得约0.9至1.1毫升的SNs。随后将其转移至锥形管中，并置于冰上保存。
然后通过加入十分之一体积的10倍刺激缓冲液来调节SNS的盐浓度。可选地加入1000倍浓度的氯化钙，使其终浓度为12阿摩尔。接着加入1毫摩尔的TTX储备液，使其终浓度为1微摩尔，以抑制非特异性兴奋。
下一步是将SNS用于相应的下游应用，例如蛋白质翻译研究。对于其他应用，可使用Pierce SDS-PAGE样本制备试剂盒对SN裂解液进行纯化或浓缩。可使用微量产BCA蛋白质测定试剂盒测定SNS中的蛋白质浓度。
以下是六个条带或组分的示例。当小鼠大脑皮层被匀浆并在不连续的Percoll蔗糖梯度中分离时，富集的突触体（SNS）位于23%与15%界面处的第五条带中；收集该条带并进行透射电子显微镜观察。此处的蛋白质印迹图显示了完整突触小泡以及突触前和突触后结构元件的保存情况。
通过不连续蔗糖梯度分离得到的突触体（SN）组分中突触标志物增加、杂质减少，表明在加入谷氨酸后S35-甲硫氨酸掺入量的增加源于新蛋白质的合成。实验中添加了40 µM的蛋白合成抑制剂安莎霉素（anesa mycin）。该图显示，无论是否同时存在谷氨酸，加入安莎霉素（anso mycin）后，S35-甲硫氨酸掺入量均显著下降，与基础水平相比有明显差异。
因此，不连续的peral蔗糖梯度能够快速制备出高活性且相对纯净的SNS，可用于蛋白质翻译的研究。该图显示，来自不连续per core蔗糖梯度的第五条带具有最高的新合成蛋白质水平。通过将匀浆后的皮层组织依次经过孔径递减的一系列滤膜过滤，再在不连续per core蔗糖梯度上离心制备的SNS，其破碎膜成分更多，完整SNS更少，相比之下，采用不连续perol蔗糖梯度方法制备的SNS则含有更多的完整SNS。结果显示，采用不连续peral蔗糖梯度方法制备的SNS比采用滤膜过滤方法制备的SNS具有更高的新合成蛋白质活性。
来自年轻小鼠的SNS显示出比年老小鼠更高的转译活性。观看本视频后，您应能清楚了解如何通过匀浆小鼠皮层、在摆桶转子中离心匀浆液、将上清液在固定角转子中经蔗糖梯度离心，然后收集所得的突触神经区带，来分离具有转译活性的突触神经区。
查看完整文字稿并访问数千部科学视频
概述
本文介绍了一种利用不连续Percoll-蔗糖密度梯度从小鼠脑皮层制备具有翻译活性的突触体（SNs）的方法。该技术可实现快速制备，同时最大限度地减少机械损伤和毒性。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 生物化学
背景
- 突触体是研究突触功能的重要工具。
- 传统方法可能对样本造成机械损伤。
- 密度梯度可降低对细胞的毒性。
- 理解突触中的翻译活动对神经科学研究至关重要。
研究目的
- 建立一种可靠的分离活性突触体的方法。
- 提高突触体样本制备的质量，以用于科学研究。
- 促进对突触功能及作用机制的进一步研究。
使用的方法
- 小鼠脑皮层的匀浆处理。
- 离心匀浆液以分离组分。
- 将上清液应用于Percoll-蔗糖梯度液。
- 最终离心以收集突触体组分。
主要结果
- Western blot 分析证实了该组分中突触蛋白的富集。
- S35-甲硫氨酸掺入实验表明存在翻译活性。
- 与传统技术相比，该方法能有效减少机械损伤。
- Percoll 的低毒性提高了制备样品中的细胞活力。
结论
- 所述方法适用于高效制备具有活性的突触体。
- 该方法为研究突触机制提供了可靠的工具。
- 未来的研究可在此技术基础上拓展多种应用。
常见问题
行业高管相关性
突触体分离技术通过保留天然的突触前和突触后蛋白复合物，实现了对突触靶点的机制性风险评估。该方法可提供具有翻译活性的样本，真实反映生理状态下的神经递质处理过程，从而支持神经科学药物研发中的靶点验证。采用Percoll-蔗糖梯度法可减少机械损伤和细胞毒性带来的假象，提高先导化合物筛选研究的数据可靠性。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：通过维持突触小泡的摄取、储存和释放机制，验证治疗假设。
- 操作价值：通过评估再封闭神经末梢中的神经递质动态变化，实现功能靶点的验证。
- 预测价值：通过量化S35标记甲硫氨酸掺入以反映翻译活性，支持新合成蛋白质的检测，从而助力项目组合的优先筛选。
筛选与检测方法开发
- 科学价值：为测量突触蛋白翻译或药物对囊泡循环影响的下游检测，制备经过验证的生物系统。
- 操作价值：通过可控的梯度分层，提供标准化、可重复的突触小体产量（每皮层0.9–1.1 mL），批次间变异极小。
- 检测适用性：适用于需要完整突触末梢并保留突触前和突触后标志物的化合物筛选平台，具有良好的可扩展性。
转化与临床前研究
- 转化连续性：从发现到中枢神经系统靶向调节剂的临床前验证，全程维持与疾病相关的突触蛋白复合物。
- 机制去风险化：通过关联谷氨酸刺激的S35-甲硫氨酸掺入与突触小泡循环，确认靶点作用机制。
- 基于风险调整的推进：根据转化活性水平做出推进或终止决策，该活性在幼年（P13–P21）小鼠皮层中较高，并可被放线菌素等蛋白质合成抑制剂降低。
流程与工作流整合
该方法适用于从靶点假设验证到先导化合物筛选的发现连续过程，在开展临床前药效学研究之前，突触功能检测可为化合物的优先排序提供依据。
- 发现生物学：通过分离突触富集组分并利用蛋白质印迹法验证突触标志物及降低杂质水平，支持假设检验。
- 筛选：提供可用于检测的突触体（SNs），输出如S35-甲硫氨酸掺入率等定量结果，便于比较化合物对蛋白质合成的影响。
- 分析：生成翻译活性测量数据，帮助研究团队比较不同条件或遗传模型下突触功能状态的差异。
- 转化研究：通过保留与神经退行性疾病或神经精神疾病适应症中生物标志物匹配相关的突触小泡循环机制，衔接临床前研究工作。
- 企业级复用：建立可重复使用的皮层突触体（SN）制备平台，适用于多个研究突触蛋白质翻译或药物诱导小泡动力学调控的项目。
运营与企业影响
- 科学价值：通过保留神经递质的摄取、储存和释放能力，实现对突触靶点结合的预测性信心。
- 操作价值：采用等渗Percoll-蔗糖梯度法进行标准化，避免使用细胞毒性培养基并减少离心步骤，提高实验可重复性。
- 战略价值：通过量化翻译活性作为功能性突触读出指标，优化“推进/终止”决策，降低中枢神经系统项目在后期阶段的生物学风险。
- 项目组合影响：基于化合物对SN蛋白合成的剂量依赖性效应进行风险校正后的优先级排序，支持在靶点验证中实现资本效率。
实施注意事项
- 需要具备组织解剖、匀浆技术和密度梯度制备方面的专业知识，以避免皮层损伤并确保清晰的分层界面。
- 依赖离心基础设施（摆桶转子和固定角转子）以及全程温度控制（4°C），以维持突触体（SN）的完整性。
- 需要跨团队标准化匀浆冲程次数和梯度层体积，以最小化不同操作者之间在突触体产量和活性上的差异。
- 适应性考虑因素包括调整P13–P21小鼠的年龄以匹配发育阶段的突触特征，并优化TTX浓度（1 µM）以在后续实验中抑制非特异性神经元兴奋。
- 实际限制包括解剖后需快速处理以防止活性丧失，以及需要通过S35-甲硫氨酸掺入或蛋白质印迹法（western blot）验证来确认突触组分的富集效果。
