全面采样与处理骨髓以检测急性髓系白血病中可测量残存病灶及白血病干细胞的实验方案

本方案的总体目标是对急性髓系白血病患者的骨髓样本进行可测量残留病（MRD）的准确检测，包括白血病干细胞的定量分析。该方法可对急性髓系白血病患者骨髓样本中的可测量残留病提供准确评估。该方法的主要优势在于，严格遵循本方案可获得高度可重复且高质量的结果。

该技术的应用意义延伸至临床决策，因为它可作为评估患者对治疗反应的读数。演示该操作流程的人员包括血液科医生耶罗恩·扬森（Jeroen Janssen）、诊断血液学实验室技术员格尔特·赛姆（Gerrit Sijm），以及微小残留病（MRD）团队的技术员詹妮弗·舍克（Jennifer Scheick）和桑德·斯内尔（Sander Snel）。让患者取侧卧位，用笔标记出髂后上棘，然后用含0.5%至1%氯己定的乙醇溶液以由内向外的环形方式对预定活检区域的皮肤进行消毒。

局部麻醉后，用手掌握住一支15号、2.8英寸长的针头，将示指抵住针尖附近金属针杆的一侧以控制方向。通过轻柔但稳定的压力，以快速交替的旋前-旋后动作将针头穿过已麻醉的皮肤，朝向髂嵴进针。当针头接触到后髂嵴时，取出针芯，并将一个空的10毫升注射器连接到针头上。

轻轻回抽活塞，在注射器内形成负压，直至采集到最多10毫升的骨髓组织碎片。每次抽吸采集的骨髓量不应超过10毫升，以避免血液稀释。取下注射器，并将针芯重新插入穿刺针中。

然后，将约两毫升骨髓推出至表面皿中，并确保抽取足够的样本注入一支肝素包被的八毫升试管中，立即轻轻颠倒混匀试管。为防止凝血，骨髓加入后应尽快充分混匀含抗凝剂的试管。为获得最佳形态学评估效果，使用塑料刮刀将表面皿中骨髓穿刺物中的骨髓小粒转移至载玻片上，再小心地将另一张载玻片覆盖在骨髓样本上并轻轻推移。

干燥后，使用 May-Grunwald Giemsa 染色骨针，以便通过光学显微镜进行分析。将骨髓样本管放入塑料支架中，并将支架置于含有常温凝胶包和已填写完毕的申请表的塑料容器内。在通过流式细胞术分析骨髓之前，启动流式细胞仪并打开流式细胞分析软件，创建一个新的实验，设置前向散射光对侧向散射光的散点图。

为了评估细胞的大小和颗粒度，加载来自健康供体的未标记裂解外周血细胞，并选择“采集细胞”功能。圈选淋巴细胞，并调整前向散射和侧向散射电压，使门控细胞群体达到适当的平均目标值。然后，至少采集10,000个事件的数据。

为了设置目标荧光通道的光电倍增管电压，首先根据制造商的说明使用八峰彩虹校准微球，在低流速下采集10,000个事件。在前向散射与侧向散射点图中圈选单一群微球，随后在FITC-PE点图中圈选第7峰。针对每种荧光染料，圈选相应的微球群体。

继续采集八峰彩虹微球悬液，并根据制造商的说明，调整并精细调节所有荧光通道的光电倍增管（PMT）电压，以达到目标的平均荧光强度（MFI）值。使用“记录”功能收集约 2,000 个事件的数据，并检查第 7 峰微球的 MFI 值。随后，向各实验用荧光染料偶联抗体中加入足够体积，用于染色相应荧光管中的微球（除一个对照管外），并充分涡旋混匀各管。

创建一个新的空白实验，使用相同的补偿参数，并确保前向散射阈值设置为 5,000，且所有荧光染料的补偿值均为零。为创建补偿对照，选择“创建补偿对照”功能并加载未染色对照管。调整 P1 门以圈选单一群微球细胞群，并确认 P1 门内仅包含单一群微球。

右键单击 P1 门，然后选择“应用于所有补偿对照”。接着，记录所有单标记荧光管的数据，确认 P2 门在每张荧光直方图上均包含阳性细胞群。为进行流式细胞术分析而染色细胞时，将骨髓样本运送至实验室，核对申请单以确认患者的研究所编号和出生日期，并确定需要染色的项目。

对于微小残留病（MRD）检测，我们使用包含四个试管的染色组合。此处我们演示由一个试管组成的LSC组合的染色过程。细胞计数后，将适量的骨髓样本转移至新的15毫升离心管中。

加入裂解缓冲液，体积为实验细胞体积的10倍，以裂解红细胞。倒置离心管混匀，室温孵育10分钟。裂解结束后，通过离心收集细胞沉淀。

将细胞在室温下重悬于15毫升洗涤缓冲液中，然后通过离心再次收集细胞沉淀。同时，将适量的抗体混合溶液加入5毫升FACS管中。此处显示的是干细胞管的检测方案。

将沉淀重悬于洗涤缓冲液中，并将细胞悬液加入含有单克隆抗体混合溶液的FACS管中，避光孵育15分钟。然后用洗涤缓冲液洗涤细胞，并通过离心收集细胞沉淀。离心后，将沉淀重悬于400 µL新鲜洗涤缓冲液中。

为了分析白血病干细胞，向已用干细胞抗体混合物染色的细胞悬液中加入四微升空白微珠。然后，使用先前设定的参数读取样本，从实验患者样本中至少获取四次10的6次方个事件。为了鉴定在约90%的急性髓系白血病患者中观察到的白血病相关免疫表型，必须正确设置原始细胞门，如图所示。

此处展示了携带不同类型CD34阳性原始细胞异常的个体患者的检测数据示例。在这些图表中，可以观察到一名持续处于完全缓解状态的患者，以及一名在诱导治疗第二个疗程后出现可测量残留病（MRD）阳性结果并随后复发的患者，这凸显了在样本分析前准确设门的重要性。对白血病干细胞（LSC）的鉴定与定量，需要进一步针对CD34阳性CD38阴性原始细胞上的特异性异常进行额外分析，如图中所示。

在执行本方案时，骨髓取样、运输、实验操作及分析步骤均需配备专业人员及后备人员，这一点至关重要。该方法还可用于进行细胞遗传学和分子学分析，以探讨特定细胞群与目标分子异常之间的相关性，或进一步明确患者的危险分层，从而预测其临床预后。该技术建立后，为血液学领域的研究人员探索急性髓系白血病（AML）患者治疗后的微小残留病提供了重要途径。

观看本视频后，您应能够充分理解如何利用流式细胞术准确识别和定量残留病灶，包括急性髓系白血病（AML）患者骨髓样本的采集与运输。