测定增殖与静息状态下人成纤维细胞全基因组转录本降解速率

本实验的总体目标是监测增殖期和静止期成纤维细胞中的转录本降解速率。该方法有助于解答分子生物学领域的一些关键问题，例如基因表达水平的变化是否源于转录本降解速率的改变。该技术的主要优势在于，它不仅能提供转录本丰度的信息，还能直接反映转录本的降解速率。

开始实验方案时，需建立成纤维细胞的增殖培养和静止培养体系。增殖期的成纤维细胞应定期用胰蛋白酶消化传代。静止期培养可通过在常规培养基更换条件下使细胞培养板达到汇合状态来建立。

向所有生物学重复的细胞培养板中预热的 10 毫升培养基加入 150 微升放线菌素 D（ActD）。放线菌素 D 的终浓度为每毫升培养基 15 微克。充分混匀溶液。

吸弃旧的培养基，向细胞中加入含有放线菌素D（ActD）的培养基。为收集零时间点样品，轻柔吸弃含放线菌素D的培养基，用移液器将5至10毫升预温的PBS加入100毫米培养皿中（100毫米培养皿加5毫升溶液，六孔板每孔加2毫升，十二孔板每孔加1毫升）。然后轻柔吸弃PBS。

然后将苯酚- guanidine 异硫氰酸溶液直接加入细胞培养板中。用移液器将苯酚- guanidine 异硫氰酸溶液与细胞混合物上下吹打数次，以形成均一的混合液。按照前述方法，在相应时间点经过后，依次收集各时间点的样品。

将样品在室温下孵育五分钟，以确保RNA蛋白复合物完全溶解。随后加入可通过所用方法检测的外源性对照转录本。将这些对照以已知的数量和浓度加入每个样品中。

使用移液器将苯基硫脲氰酸酯溶液混合物转移至一个 2.0 毫升的微量离心管中。然后每使用 1 毫升苯基硫脲氰酸酯溶液，向该混合物中加入 0.2 毫升氯仿。剧烈振荡微量离心管 15 秒，随后孵育氯仿-苯基硫脲氰酸酯混合物。

孵育后，在4°C条件下以12,000 × g离心20分钟。样品应分为三层。使用微量移液器将水相转移至新的2.0 mL微量离心管中，注意在此过程中不要扰动中间相。

弃去中间层和有机相。然后向水相中加入等体积的2-丙醇，并将离心管颠倒10次。每20微升样品中最多加入1微升浓度为20毫克/毫升的水性糖原溶液，特别是当预期得率较低时。

将样品在室温下孵育10分钟。孵育结束后，离心样品。确保离心结束后，RNA已沉淀并在离心管底部形成白色沉淀。

用移液器小心吸除并弃去上清液，注意不要扰动白色的 RNA 沉淀。每 1 毫升苯基胍异硫氰酸酯溶液试剂中加入 1 毫升 75% 乙醇以洗涤沉淀。将样品在 12,000 × g 离心 10 分钟。

除去大部分上清液后，用移液器尽可能吸除乙醇，但不要扰动沉淀。短暂离心样品以沉淀残留的过量乙醇。此时RNA沉淀较为松散，容易移动。

离心后，从离心管中完全去除上清乙醇，注意不要扰动沉淀。将RNA沉淀在室温下晾干5分钟。向RNA沉淀中加入50 µL无核酸酶的水，并用无核酸酶的水重悬沉淀。

加入一微升Deanase处理样品以去除DNA，随后灭活Deanase及阳离子。将RNA样品储存于2.0毫升微量离心管中，置于负80摄氏度保存。使用分光光度计对RNA进行定量，并检测RNA纯度。

在检测纯度后，使用1%琼脂糖凝胶分析RNA，以观察其降解程度。应清晰可见代表18S和28S rRNA的两条明显条带。若这两条条带不可见，则RNA可能已降解。

接下来，使用实时定量 PCR 检测收集的 RNA 等分试样中转录本的丰度，并与加入的内参标准品进行比较。也可使用微阵列、RNA 测序或 Northern 印迹技术。随时间变化的荧光强度对应于基因表达水平。

尽管成纤维细胞会出现接触抑制现象，但编码III型胶原蛋白A1（Collagen 3A1）的转录本——一种在伤口愈合过程中形成细胞外基质非常重要的基因——其稳定性会增加，降解速度减慢。请务必注意，苯酚具有极高的危险性，切勿让其接触皮肤。观看本视频后，您应能够充分理解如何监测增殖期和静止期成纤维细胞中转录本的降解速率。

转录本降解速率的变化可能是基因三角调控的重要机制。