分析天然铀对生物系统影响的方法 体外 破骨细胞生成
2018年1月30日
已知铀会影响骨代谢。本文介绍了一种研究天然铀暴露对破骨细胞活力、分化及功能影响的实验方案，破骨细胞是负责骨吸收的细胞。
本实验的总体目标是研究天然铀暴露对破骨细胞活力、分化及功能的影响。该方法有助于解答环境毒理学领域中的关键问题，即铀暴露对骨骼生理学和代谢的影响。该技术的主要优势在于，它为铀暴露源的筛选提供了一种新颖且有价值的工具。
当 RAW 264.7 细胞培养达到 85% 至 90% 汇合度时，使用细胞刮刀将细胞从细胞培养瓶底部机械刮下，并将细胞转移至无菌的 50 毫升锥形管中。用移液器反复吹打细胞悬液数次以分散细胞团块，计数所得的单细胞悬液。用添加了 L-谷氨酰胺和 5% 胎牛血清的 α-最低必需培养基将细胞稀释至 1 × 10⁴ 个细胞/毫升的浓度，并向 24 孔细胞培养板的每孔中加入 1 毫升细胞悬液，在 37°C 条件下孵育 6 小时。
影响破骨细胞分化及再吸收实验可重复性的一个重要参数是细胞接种密度。在接种细胞前，请特别注意细胞计数、细胞悬液的制备及其均匀性。制备尿盐溶液时，从经无菌细胞培养验证的7.5%碳酸氢钠水溶液开始，先在冰上制备并冷却100毫摩尔/升的碳酸氢盐水溶液，然后在轻柔振荡条件下，将一份体积的100毫摩尔/升尿酸醋酸盐溶液逐滴加入九份体积的冰冻碳酸氢盐溶液中。
将溶液在室温下平衡。三小时后，将适当体积的尿液溶液逐滴稀释到含有50纳克/毫升RANKL的分化培养基中，直至达到所需的尿液工作浓度，然后在室温下再平衡三小时。每次稀释尿液盐后的长时间孵育步骤对于溶液中尿液复合物的稳定至关重要。
第二次平衡期结束时，根据需要，用一毫升经尿液处理或对照处理的培养基轻轻替换每个孔中的原有培养基，并将细胞放回培养箱中继续培养。多核破骨细胞应在培养的第3至第4天出现。为评估新分化破骨细胞的大小和形态，应按照制造商说明书对细胞进行抗酒石酸酸性磷酸酶染色，并以足够分辨细胞核的分辨率对每个孔的整个表面进行成像。
当所有孔都成像完成后，使用开源的 ImageJ 软件打开其中一个孔的图像，并验证尺度单位。然后在弹出窗口中勾选“全局”选项，以便将新的尺度单位应用于后续所有图像。在“分析”菜单下，选择“设置测量”并勾选“面积”和“显示标签”选项。
取消选中所有其他复选框。在“分析”菜单下，打开“工具”，然后打开“感兴趣区域管理器”，并在主 ImageJ 窗口中选择矩形选择工具。勾画一个约 1,000 乘 1,000 微米的感兴趣区域，然后单击“添加”按钮，将该选区加入感兴趣区域管理器中。
然后单击“更多”，再单击“保存”以保存该区域。如需创建五个待分析区域之一的副本，请在“感兴趣区域管理器”中选择目标区域，然后在所选区域内单击鼠标右键以复制该区域。勾选“显示全部”和“标签”复选框，并选择多边形选择工具，手动勾画出复制的感兴趣区域中的一个破骨细胞轮廓。
要将此轮廓添加到“感兴趣区域管理器”，请单击“感兴趣区域管理器”窗口中的“添加”按钮。当所有破骨细胞均已被添加后，选中所有轮廓，然后单击“测量”以测定其表面积。随后将结果窗口中显示的测量数据转移至电子表格中。
为了评估经尿液处理的破骨细胞功能，在添加分化培养基的前一天，将来自85%至90%融合度细胞培养物的RAW细胞接种至24孔骨分析板中，使用生长培养基，操作方法如前所述。次日，轻轻将上清液替换为含尿液的分化培养基，使RAW细胞分化为破骨细胞，操作方法如前所述。在破骨细胞生成的第五天，将含尿液的培养基替换为10%次氯酸钠溶液，以去除仿骨表面的细胞。
室温孵育5分钟后，用去离子水洗涤孔板两次，并使其自然风干。接着，用1%茜素红S钠盐溶液对每个孔中未被吸收区域的钙盐进行染色。染色10至15秒后，移除茜素红溶液，并用清水轻轻洗涤孔板三到四次。
要将茜素红染色孔的 RGB 图像转换为灰度、8 位格式，请在“图像”菜单下选择“类型”和“8 位”。然后，使用椭圆选择工具勾勒出待分析吸收区域的整个孔表面，并保存该感兴趣区域，方法如前所述。为便于选择阈值，请选择“编辑”和“清除外部”以清除定义的感兴趣区域之外的所有特征。
按照刚刚演示的方法复制感兴趣区域，然后在“图像”菜单下选择“调整阈值”，通过调节滑块来选择合适的阈值。所有被吸收的区域应高于阈值并显示为白色，而所有未被吸收的区域应低于阈值并显示为红色。为完成阈值的选择，在“阈值”窗口中点击“应用”，并将最终的二值图像以所需的适当格式保存。
为了定义在感兴趣区域内要进行的测量，在“分析”菜单下选择“设置测量”，勾选“面积”、“面积分数”和“限定于阈值”选项，取消勾选所有其他选项。然后，为了直接在结果窗口中获得吸收区域的分数，通过在“编辑”菜单下选择“反相”来反转复制的二值图像，并确保最终的二值图像中已选中主要的感兴趣区域，进而测量吸收区域的分数。铀处理后新分化破骨细胞数量和大小的变化在整体孔板的复合图像以及选定感兴趣区域的放大图像中均清晰可见。
不同培养条件下生长的破骨细胞的大小，可通过勾勒出每个区域内所有破骨细胞并测量每个勾勒细胞的面积来进行分析，方法如前所述。为研究铀对破骨细胞吸收活性的影响，将 RAW 264.7 细胞接种并在模拟骨表面的培养板上进行分化。在实验结束时，去除破骨细胞，对未被吸收的区域进行染色并成像，操作如前所述。
然后将图像转换为8位灰度图并进行阈值处理，以方便计算骨吸收区域。该方法也可用于研究其他重金属对破骨细胞生成的影响。
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概述
本研究探讨天然铀暴露对破骨细胞活力、分化及功能的影响。该实验方案旨在加深对铀对骨代谢影响的理解。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 环境毒理学
- 骨生理学
背景
- 已知铀会影响骨代谢。
- 破骨细胞负责骨吸收。
- 了解铀的影响有助于环境健康研究。
- 本研究为环境毒理学领域提供了贡献。
研究目的
- 研究铀对破骨细胞的影响。
- 评估细胞活力和分化能力。
- 探讨铀暴露对骨骼健康的潜在功能影响。
使用的方法
- 使用 RAW 264.7 细胞培养进行研究。
- 通过机械法收集细胞并进行计数分析。
- 将细胞稀释后置于受控环境中孵育。
- 该方法可用于筛选铀对骨细胞的影响。
主要结果
- 该方案可揭示铀暴露条件下破骨细胞的行为特征。
- 实验结果可能表明细胞活力与功能的变化。
- 研究发现有助于理解环境因素对骨代谢的影响。
- 为深入研究铀的生物学效应提供了可能。
结论
- 本研究为探究铀的毒性提供了一种新工具。
- 理解破骨细胞的反应对于骨骼健康至关重要。
- 未来的研究可在此发现的基础上，进一步探索其更广泛的意义。
常见问题
行业重要性概述
对铀对破骨细胞生成影响的定量分析，有助于在骨毒性研究中进行机制性风险消除，并为环境危害评估提供可预测性依据。本方案提供了标准化且可重复的工作流程，用于评估细胞毒性及对骨吸收细胞功能的影响，为早期靶点验证和风险分级提供支持。该方法直接适用于生物制药团队在骨代谢、毒理学以及环境暴露风险方面的研究。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 能够探究铀对破骨细胞分化和功能的机制性影响。
- 通过量化细胞毒性及骨吸收活性的变化，支持生物学风险降低研究。
- 有助于提高环境与靶向骨毒性模型的预测可靠性。
筛选与检测方法开发
- 建立经过验证的体外系统，用于筛选重金属对骨细胞生物学的影响。
- 标准化细胞接种、培养基制备和基于图像的定量方法，以确保可重复性。
- 生成可用于下游分析的定量结果，如破骨细胞大小和基质吸收百分比。
转化与临床前研究
- 将体外研究结果与骨代谢和毒理学中与疾病相关的终点指标相对应。
- 实现从机制发现到临床前危害识别的连贯性。
- 支持基于风险评估推进环境毒性研究项目。
流程与工作流整合
本方案整合到从发现到临床前的骨毒性及环境危害评估连续流程中。
- 发现生物学：支持对铀的细胞效应进行假设验证，并阐明破骨细胞生成过程中的相关通路。
- 筛选：提供可重复、定量的检测结果，用于化合物或暴露因素的评估。
- 分析：提供基于图像的细胞大小和基质吸收面积测量，用于比较分析。
- 转化研究：将体外机制数据与临床前毒理学终点相衔接。
- 企业级复用：提供可重复使用的实验流程，用于评估其他重金属或环境因子对骨细胞的影响。
运营与企业影响
- 科学价值：提高骨毒性研究的预测可信度，降低机制上的模糊性。
- 操作价值：提供标准化、可扩展且可重复的检测方案。
- 战略价值：优化环境与靶向骨组织研发项目中的立项或终止决策及资金分配。
- 项目组合影响：实现对环境危害与骨代谢项目的风险调整后优先级排序。
实施注意事项
- 需要具备细胞培养、图像分析和定量实验设计方面的专业知识。
- 需要使用成像平台及ImageJ等分析软件。
- 为确保可重复性，需对细胞接种和培养基制备进行严格标准化。
- 通过优化实验方案，可适用于其他细胞系或重金属暴露研究。
- 局限性包括体外模型的固有局限性，以及图像分析中需要谨慎设置阈值。
