一种简单的骨吸收陷窝实验方案用于可视化和定量破骨细胞的骨吸收 体外

本方案描述了一种简单且可靠的破骨细胞吸收活性检测方法。利用实验室常见的材料即可轻松制备并观察磷酸钙包被的细胞培养板。与不透光的骨片或牙本质切片相比，磷酸钙涂层可同时实现对吸收陷窝和细胞的可视化观察。

在本实验方案中，我们使用外周血单个核细胞（PBMCs）进行破骨细胞分化。然而，该方法也可应用于其他细胞类型，如骨髓来源的单核细胞或Raw 264.7细胞。首先取一个平底96孔细胞培养板，将300微升预先配制的磷酸钙溶液加入每个孔中。

然后，盖上培养板盖子，在37摄氏度下孵育三天。三天后，从预先钙化的96孔细胞培养板中吸除预钙化溶液，并向每孔加入300微升磷酸钙溶液。盖上培养板盖子，在37摄氏度下孵育一天。

然后将平板倒置，倒出溶液，并用去离子水彻底清洗平板三次。立即使用吹风机或压缩的二氧化碳或氮气将平板吹干，以保持表面均匀。现在，将涂覆好的平板置于洁净台中，用紫外线照射一小时。

立即使用包被好的酶标板，或用封口膜密封后于室温保存。将15毫升新鲜血液与等体积的PBS稀释液混合，通过反复倒置或移液数次充分混匀。然后取15毫升密度梯度溶液加入50毫升锥形管中，倾斜试管，将30毫升稀释后的血液样本小心地铺加在15毫升密度梯度溶液上层。

随后，将离心管置于水平转子中，在20摄氏度下以810 ×g离心20分钟，离心过程中不得使用刹车。然后吸除上层液体，保留位于界面处的单个核细胞层不受扰动。小心地将单个核细胞层转移至新的50毫升锥形管中。

用PBS填充试管，混匀后在20摄氏度下以300 × g离心10分钟。将PBMCs重悬于含20纳克/毫升巨噬细胞集落刺激因子的完全α-MEM培养基中，并以每平方厘米2.5 × 10⁵个细胞的密度将PBMCs接种至培养瓶中。将磷酸钙包被的培养板与50微升胎牛血清在37摄氏度下孵育1小时。

随后，用 PBS 清洗培养瓶两次，以去除死亡或非贴壁细胞，从而分离破骨细胞前体细胞，然后每 75 平方厘米培养瓶中加入 4 毫升胰蛋白酶。30 分钟后，加入 4 毫升完全 α-MEM 培养基终止消化，再使用细胞刮轻轻刮下细胞。将细胞转移至 50 毫升离心管中，使用细胞计数板对细胞总数进行计数。

将离心管在350 × g条件下离心7分钟，使细胞沉淀，然后将沉淀重悬于含有M-CSF和RANKL的完全α-MEM培养基中，调整细胞浓度至1 × 10⁶ 个细胞/毫升。吸去磷酸钙包被板中的胎牛血清，每孔加入200 µL细胞悬液。孵育后，用PBS洗涤细胞两次。

用 4% 多聚甲醛固定细胞 10 分钟，再用 PBS 洗涤。染色时，向固定后的细胞中加入通透缓冲液，孵育 5 分钟。为染色肌动蛋白纤维，将细胞与 100 µL PBS 中的 Alexa Fluor 546 标记的鬼笔环肽溶液孵育 30 分钟，然后吸除染色液，再加入 100 µL Hoechst 溶液染细胞核 10 分钟。

用100微升10微摩尔的钙黄绿素和PBS对磷酸钙涂层染色10分钟。用PBS洗涤三次后，采集图像。对于磷酸钙涂层的Von Kossa染色，向每孔加入50微升5%硝酸银和去离子水，并在紫外光下孵育平板1小时，直至孔底部的涂层变为棕色。

96孔板底部的磷酸钙涂层呈现均匀且附着良好。在含有M-CSF和RANKL的培养基中，于磷酸钙涂层板上培养9天后，破骨细胞前体形成了吸收陷窝和大型破骨细胞。位于陷窝内的多核破骨细胞高表达TRAP。

成熟的破骨细胞显示出含有三个或更多细胞核以及明显的肌动蛋白环。绿色的磷酸钙涂层上可见黑色的吸收陷窝。使用 ImageJ 的阈值工具测量陷窝区域的荧光图像。使用 ImageJ 的 ROI 管理器和多边形选择工具计算破骨细胞的数量和大小。在无 RANKL 条件下培养的破骨细胞前体无法形成吸收陷窝，而 M-CSF 和 RANKL 可促进成破骨细胞陷窝的形成。

使用 ImageJ 对蚀坑区域进行定量分析。立即用气流干燥包被好的培养板有助于形成均匀的磷酸钙涂层，否则容易在孔的中央形成较厚的涂层。