单个酵母细胞中MAPK诱导表达的时间定量分析

以下实验的总体目标是在单细胞水平上定量有丝分裂原激活蛋白的表达。为实现这一目标，构建了一种酵母菌株，该菌株携带由STL1启动子控制、特异性响应hog1 MAP激酶激活的四倍Venus荧光表达报告系统。荧光蛋白的表达可通过活细胞显微成像实验进行定量，即在显微镜下直接对细胞施加胁迫，以促进荧光的实时出现；也可通过流式细胞术进行定量，此时细胞在微量离心管中受到胁迫，并在特定时间点阻断蛋白质合成。

通过添加环己酰亚胺，每次只能利用活细胞显微镜分析少量细胞，但可以直接观察单个细胞的命运，并将其与其他细胞特性相关联；而流式细胞术则能够在单次实验中对大量细胞的丝裂原活化蛋白表达情况进行评估。该方法有助于回答信号转导领域中的关键问题，例如哪些蛋白质参与了基因表达的调控。尽管该方法可为酵母信号通路研究提供见解，但只要具备合适的报告基因，也可应用于其他信号级联途径。

为进行活细胞显微镜观察，首先在5 mL合成培养基中接种酵母，并于30 °C过夜培养细胞。次日早晨，测定过夜培养物在600 nm处的光密度（OD 600），然后将过夜培养物用5 mL合成培养基稀释至OD 600为0.05。将稀释后的培养物在30 °C继续培养至少4小时以上。

接下来，将约 200 微升新配制的刀豆蛋白 A 溶液过滤到凹玻片中。30 分钟后，吸除刀豆蛋白 A 溶液，并向凹槽中加入 150 微升水。然后吸去水，让凹槽干燥，同时准备细胞。

再次测量细胞培养物在600 nm处的光密度（OD 600），然后将细胞稀释，以获得300微升、OD 600为0.02的细胞培养液，置于1.5毫升微量离心管中。将细胞在水浴中超声处理45秒。短暂涡旋振荡微量离心管，然后再次进行超声处理和涡旋振荡。

现在将 200 微升细胞加入到孔玻片中，静置约 30 分钟使细胞沉降到孔底后，将玻片置于显微镜上。接着，选择待记录的荧光通道照明设置，以及两个明场图像的设置，将其中一个明场设置调整至焦平面下方约三微米处，以实现准确的细胞分割。然后设定延时成像的时间间隔，并选择成像的视野区域。

现在开始采集几帧图像，然后暂停采集，加入100微升新配制的0.6摩尔氯化钠溶液，继续成像，以准备进行流式细胞术检测。首先将酵母接种于5毫升合成培养基中，在30摄氏度下过夜培养。次日早晨，测定过夜培养物在600纳米处的光密度（OD 600），然后将细胞悬液用5毫升合成培养基稀释至OD 600为0.1。

在30°C下培养菌液至少4小时，使其OD 600达到0.2至0.4。然后，为每个待测时间点准备一个1.5毫升微量离心管，在零时刻加入100微升新配制的0.6摩尔氯化钠溶液。向每管中加入200微升菌液，并在30°C下振荡培养。

然后在每个实验时间点，向其中一个微量离心管中加入 30 微升 freshly prepared cyclo heide。在微量离心管孵育的同时，为每个微量离心管向相应的 fax 管中加入 400 微升 PBS。孵育结束后，短暂涡旋震荡微量离心管，然后对细胞进行超声处理，并如刚才所示在水浴中超声一分钟。

然后将每个微量离心管中的100微升细胞培养物加入流式细胞仪中对应的流式管。加载适当的激发和检测设置，并检测非表达和完全表达的样品，以确认其处于检测器的灵敏度范围内。最后，对每份样品测量10,000个细胞。在这些图像中，携带由TL1启动子调控的表达报告基因四聚体静脉蛋白的酵母细胞被固定在玻片孔底部，并通过直接添加应激培养基进行刺激。

如刚刚所示，细胞以10分钟为间隔监测约两个小时，并在刺激施加前后均采集了图像。请注意报告基因在活化细胞中的荧光表达。为了提取这些图像中包含的定量信息，必须在此进行复杂的图像分析过程。

展示了利用酵母定量分析平台获得的结果。每条红色轨迹代表单个细胞平均荧光强度随时间的变化过程。蓝色线条表示从同一孔中五个不同视野采集的时间序列影片的20帧图像中，超过500个被分割并追踪的细胞的中位数；浅蓝色区域表示在特定时间点测得的所有荧光强度的第25和第75百分位数。为了通过流式细胞术研究同一报告基因表达的动力学特性，放线菌酮（Cycloheximide）在不同时间点以5至10分钟的间隔被添加到酵母细胞培养物中。

该药物阻断新蛋白质的合成，但已表达的荧光蛋白的成熟过程不受影响。因此，可通过观察直方图向右偏移来量化Cycl H编辑时的蛋白表达，从而规避与荧光蛋白成熟相关的问题。在该图中，通过显微镜或流式细胞术测量的报告基因表达动力学进行了比较；显微镜结果显示，在施加应激培养基后30至40分钟荧光信号才开始上升，而流式细胞术的测量结果明确表明，蛋白质在刺激后10至15分钟内即已开始产生，证明了荧光蛋白成熟过程较为缓慢。

这两种技术均可在这些简单实验中获取单细胞信息，三次生物学重复之间的差异较小，远小于通过显微镜或流式细胞术观察到的单细胞反应的巨大变异性。在完成这些操作步骤后，还可进行其他类似的方法，例如上述的响应测量，以回答更多问题，比如基因表达的阈值是多少。观看本视频后，您应能够充分理解如何利用显微镜或流式细胞术在单细胞水平上检测蛋白质表达。