通过鱼类之眼研究糖尿病：成年tg(fli:EGFP)斑马鱼视网膜血管系统的显微解剖、可视化与分析

本成年斑马鱼视网膜血管系统解剖方案的总体目标是，通过荧光显微镜或激光扫描共聚焦显微镜，快速评估与新生血管形成及结构改变相关的长期血管病变。该方法有助于解答微血管并发症领域中的关键问题，例如糖尿病性视网膜病变的发生发展机制。该技术的主要优势在于，能够在生理状态和疾病过程中，以相对快速且标准化的方式完整呈现并分析整个视网膜血管系统，而无需使用血管内荧光标记物。

首先，将每份样本六毫升新配制的4% PFA PBS溶液转移至六孔板的孔中。按照文本方案实施成年斑马鱼安乐死后，将其置于干净的纸巾上并吸干。使用解剖刀在鳃盖后方切断头部。

然后将头部直接转移至新配制的固定液孔板中。将含有鱼头的孔板在4°C下保存至少24小时，以确保固定液充分渗透至视网膜深层。用加热的2%琼脂糖填充培养皿至三分之一高度，待琼脂凝固后备用。

用一倍 PBS 覆盖琼脂平板，以创建解剖眼球的工作区域。将固定后的样本转移至培养皿中。用一把镊子夹住头部的切面，另一把镊子夹住眼眶窝下方的眼球部位，小心插入。

缓慢张开镊子，置于眼球下方，夹住视神经。然后小心撕开并摘除眼球。为去除附着在眼球上的四条直肌和两条斜肌等眼外肌，以及连接眼球与眼眶的残余眼外组织，可用半闭合的镊子固定眼球，另一把镊子夹住目标结构，通过相对方向的轻柔动作将其轻轻撕下。

接下来，使用27号一次性针头在角膜的外围区域穿刺。通过此开口，用镊子夹住角膜并轻轻将其撕开。然后仔细操作，形成一个与相应瞳孔大小相当的居中撕裂口。

在眼球角膜侧的虹膜上方角膜外缘处施加压力。这将形成一个小凹陷，并将晶状体推至角膜撕裂口的高度。然后将镊子伸入晶状体下方，将其取出。

接下来，将眼球翻转，使视神经朝上。需要注意的是，巩膜与角膜相连，共同构成眼球壁的纤维膜，以保护杯状的视网膜。该外壳称为角巩膜，但在视神经周围区域除外。

在此处的巩膜中断处插入针头，以在巩膜与视网膜之间创建开口。然后利用此通路，用镊子小心地沿轴向将巩膜撕成条状，以扩大视神经周围的开口。注意在向角膜侧边缘过渡时，保持角巩膜交界处的完整性。

在将角巩膜从剩余的眼内组织上剥离之前，应尽量切断任何连接，因为与其他结构的附着将成为关键问题。然后用一把镊子夹住巩膜，另一把镊子夹住视神经并向外牵拉，从而将角巩膜完全从眼球上移除并丢弃。此步骤将获得一个由葡萄膜和视网膜组成的杯状结构，其中包含视网膜血管系统。

接下来，将27号针头侧向抵住残留的杯状结构，用针尖边缘刮擦其外表面，从而在脉络膜和视网膜色素上皮（RPE）层上制造一处破裂。利用该破裂口作为切入点，夹住脉络膜和RPE层，并使用两把镊子将其撕成条状，同时保持其与虹膜的连接完整。随后，将一把镊子从虹膜下方穿过，并从外围沿环形移动，同时通过牵拉已断开的脉络膜和RPE层施加张力，从而分离整个复合结构。

如果虹膜部分无法被移除，并在去除脉络膜和视网膜色素上皮层后仍与杯状视网膜相连，则可利用成年斑马鱼眼球光感受器层内存在的另一个天然断裂点。采用类似于去除虹膜的方法，轻轻刮擦残留的杯状视网膜，以在光感受器层中诱导产生间断。

然后利用已建立的通路去除该层组织，同时保持与虹膜可能存在的连接完整。随后，将镊子伸入虹膜下方，按照本视频前面演示的方式沿环形路径继续操作，以分离整个复合结构。在分离虹膜与其下方组织时，必须采用合理的方式将其彻底断开，因为在观察血管时，未分离的虹膜会遮挡内侧视光学环正上方的荧光信号。

过于直接的操作可能导致血管破裂。然后使用直型、切割刃长2.5毫米的显微解剖弹簧剪，尽可能靠近视网膜处切断视神经。这将有助于组织更理想地进行平铺封片。

为了安装和观察视网膜血管系统，使用一倍浓度的磷酸盐缓冲液（X PBS）将分离的视网膜清洗两次，每次五分钟。在玻璃载片上滴加一滴 PBS。然后使用带有微勺端的实验室刮勺，将视网膜转移至液滴中。

用镊子固定组织，同时使用解剖刀将杯状结构切开，根据视网膜大小制成平坦的四瓣或五瓣形状。用一小片滤纸吸去残留的PBS，注意不要触碰视网膜。然后在平铺的视网膜上滴加封片剂，并加盖盖玻片。

注意避免产生泡沫，因为气泡会影响视网膜血管的观察。使用指甲油封固盖玻片。最后，通过荧光显微镜或激光扫描显微镜观察视网膜血管结构。

此处展示的是利用荧光显微镜观察到的成年转基因斑马鱼（EGFP）视网膜血管系统的形态学示例，以及利用共聚焦激光扫描显微镜成像的第二个示例，后者可减少背景荧光。所揭示的视网膜结构呈现出高度有序的模式。视动脉在视神经乳头处穿入视网膜，并在大多数样本中分支为五至七条主要血管。

主要血管随后分支形成一系列血管弓，并连接至位于平铺视网膜周边、环绕视盘的内侧视网膜环状结构，即内视网膜环（IOC），也称为周围绕静脉。成年斑马鱼视网膜由内向外依次由以下几层构成：神经节细胞层、内丛状层、内核层、外丛状层、外核层、光感受器层以及视网膜色素上皮层。

本文展示了如何从视网膜血管成像中估算血管参数。内层视网膜血管位于神经节细胞层上，而脉络膜毛细血管则与视网膜色素上皮层相关。若操作得当，该技术在经过训练后可在20分钟内完成。

在尝试此操作时，重要的是要记住定期练习，因为长时间不进行操作会降低血管完整性的实验效果。通过本操作，可在成年斑马鱼中分析糖尿病和神经血管病理学特征。