多色延时成像转基因斑马鱼：可视化通过靶向神经元细胞消融激活的视网膜干细胞

在转基因动物中表达荧光报告基因使得能够在活体疾病模型中追踪细胞对实验干预的响应。在此，通过药物诱导斑马鱼中特定细胞的选择性丢失，采用高分辨率多色共聚焦显微技术，在药物处理前、处理后即刻以及后续间隔时间点对靶向细胞及其邻近细胞进行成像。图像分析表明，在恢复阶段内源性干细胞群被激活，并随之替代了被靶向清除的细胞。

该方法有助于回答再生生物学领域中的关键问题，例如：再生特定细胞类型所依赖的细胞与分子机制是什么？首先，在受精后16小时，将从交配中收集的转基因卵转移到含有0.3 x 斑马鱼溶液的培养皿中。在目标组织出现任何色素沉积迹象之前，加入PTU以抑制酪氨酸酶活性。如果胚胎并非白化型，则将胚胎在28.5°C条件下孵育。

当报告基因表达明显时，将培养皿置于荧光体视变倍显微镜下，筛选具有目标转基因表达的个体。成像前，用胚胎培养基配制0.5%低熔点琼脂糖封片液，并将其保存在40摄氏度。

如有需要，加入三卡和PTU。轻轻混匀后放回40摄氏度。将鱼放入含有三卡的胚胎培养基中以麻醉。

鱼类将大约在三分钟内失去反应。使用微量移液器时，吸取单条鱼进入已剪裁的移液器吸头中，吸入约30微升的麻醉溶液。接着，将移液器倒置，使鱼沉降至吸头底部。

将枪头接触封片液，让其依靠重力转移。注意不要稀释农杆菌溶液，以便重复使用。弃去微量移液器中剩余的麻醉溶液。

然后使用同一吸头将鱼转移至培养皿中。在约30微升封片溶液中，轻轻调整鱼的位置，使目标区域位于液滴中心。确保鱼在封片剂凝固前保持在所需的方向。

可根据需要将多条鱼同时固定于一个培养皿中。待琼脂凝固后，将鱼样转移至共聚焦显微镜载物台上，轻轻向培养皿中加入含有三卡因（trica）并可选择性添加或不添加PTU的胚胎培养基，直至鱼样完全浸没。打开成像软件，对目标区域进行聚焦，以获得细胞和/或分子细节的最佳成像效果。

在软件中使用长工作距离且具有高数值孔径的物镜。从转盘列表中选择合适的荧光染料组合。点击光谱设置，并对发射波长范围进行调整。

为了获得清晰的报告信号分离并最大化信噪比，请在下拉菜单中选择合适的物镜，以确保软件定义的预设得到正确调整。为了聚焦激光并设置功率水平，请选择查找表中的一个输出，该输出显示每个通道的像素饱和情况。

接下来，调整检测器灵敏度以获得理想的图像质量，逐步提高激光输出，直至图像强度达到可接受水平。应避免感兴趣区域内的像素饱和，并尽可能保持激光强度处于最低水平，以减少光漂白和光毒性问题。

通过手动开启和关闭各激光线路，同时监测所有成像通道，确保每条激光线路仅在相应的通道中产生可检测信号。若未见明显串色，则可同时采集所有通道。接下来，使用缩放和旋转功能框定目标区域。

然后根据实验需求设置扫描速度和图像尺寸，使用较快的扫描速度可缩短激光驻留时间，并提高时间分辨率。根据实验需要设定Z轴步进尺寸，此处采用10微米的步进尺寸，对视网膜组织的七个光学切片进行成像。

确定适当的设置后，采集 Zack 图像并保存，然后转移到下一条鱼。根据随附书面文件中的说明，可进行连续的捕获与释放成像，以追踪连续数天内的细胞变化。

在进行多报告基因成像实验时，最好使用光谱分离良好的荧光基团，然而这并不总是可行的。本文展示了利用开源软件 ImageJ 进行简单图像减法处理的方法，以分离具有重叠激发和发射光谱的荧光基团信号。在本例中，目标为 GFP 和 YFP。

本视频中描述的时间序列成像技术已被用于监测视网膜干细胞在视网膜双极神经元消融与再生过程中的动态变化。为实现光谱分离，需采用顺序成像模式并调整滤光片设置，以分别独立采集和部分分离重叠的荧光信号。图像采集完成后，使用 ImageJ 的 LOCI Bio-Formats 导入功能打开图像文件以启动导入工具。将目标文件拖入 ImageJ 窗口中。

在导入窗口中使用“拆分通道”复选框将通道拆分为独立的图层，以启动“对齐三个TP”插件。点击“插件”，然后选择“对齐图层”，再选择“对齐三个TP”。

必须对图像堆栈进行对齐，以确保正确减除。在第一个下拉框中选择参考堆栈，在第二个下拉框中选择未对齐的堆栈。勾选“使用 XY 相对原点”和“使用 Z 相对原点”选项，然后点击确定。

要开始配准过程，请点击体积配准按钮。此时将出现一个包含配准参数的新窗口。点击确定。

此部分已由插件发行商优化，无需进行任何修改。完成后，将出现一个对齐后的图像堆栈窗口。从该对齐窗口中选择输出，以打开输出窗口。

此窗口已优化，无需修改。单击“确定”。工作区中将出现一个新图像栈，其文件标题末尾会添加“aligned”。

为了使用图像计算器去除串扰，请点击“Process”（处理），然后选择“Image Calculator”（图像计算器）。在“Image 1”（图像1）下拉框中选择要被减去的图像栈，在“Image 2”（图像2）下拉框中选择用于减法运算的图像栈。在“Operation”（运算方式）下拉框中选择“Subtract”（减法），然后点击“Okay”（确定）。

Image J 将提示是否处理该图像栈。选择“是”。随后将出现一个新的图像栈，其中已去除重叠通道之间的串扰。

合并图层以重建在配准和减影前的相同图像结构。在通道工具窗口中选择合并通道后，该工具可将最多四个图层合并为一个多通道图像（hyper stack）。最后，对各通道进行染色，并调整亮度和对比度，将文件保存为 tiff 格式，以检测硝基还原酶的靶向丢失与再生情况。

表达mCherry的视网膜双极细胞。在处理前，对单条斑马鱼进行了共聚焦图像的时间序列采集。图中显示，对照组双极细胞中表达膜定位的YFP报告蛋白（黄色），而靶向双极细胞中表达硝基还原酶与mCherry的融合蛋白（红色）。

图中以青色显示的膜标记CFP转基因为其他大多数视网膜细胞提供了背景信息，以增强清晰度。同一图像在甲硝唑处理后不显示CFP信号。表达红色硝基还原酶的双极细胞消失，而受黄色标记控制的双极细胞得以保留。

这展示了该消融方法的高度特异性。同样，为清晰起见，展示了同一位置未表达CFP的图像。当去除metro NIAZ时，表达NTR的细胞会重新回到此处。

本图展示了G-F-P-Y-F-P减法方法的一个示例，其中GFP标记的Mueller细胞以绿色显示，YFP标记的双极细胞以紫色显示。两种信号的重叠区域呈现白色，用于执行减法操作。

必须首先对 GFP 和 YFP 图像进行配准。随后通过减影处理，可将 YFP 标记的双极细胞从 GFP 图像中去除，从而清晰地呈现 GFP 标记的 Mueller ggl，并检测到较暗的 Mueller 细胞。现在可以验证红色显示的暗弱 Mueller 细胞、ggl 与 M cherry 标记的双极细胞之间的重叠部分。

此处所示数据表明，双极细胞消融会触发穆勒胶质细胞（Muller glia）以替代丢失的细胞。这一解释与近期关于视网膜再生的研究一致，这些研究指出穆勒胶质细胞在哺乳动物和鱼类中均可作为损伤诱导的祖细胞。该技术可使研究人员通过观察斑马鱼中的干细胞，探索调控特定细胞类型再生的机制。