一种高效的方法 体外 通过转录调控的睡美人系统介导的转座方法——该系统被包装至整合缺陷型慢病毒载体中

本方法的总体目标是通过转录调控的、包装于整合缺陷型慢病毒载体中的Sleeping Beauty系统，将目的基因稳定整合到原代细胞的人类基因组中。该方法有助于回答基因治疗领域中的关键问题，例如利用Sleeping Beauty系统将目的基因整合到原代细胞中的可行性。该技术的主要优势在于，可诱导的高活性Sleeping Beauty系统能够高效递送并转导对多种转染方法具有抗性的原代细胞。

本实验操作将由我实验室的博士后 Daniela Benati 演示。在转导前一天，按照文本方案中所述方法培养人原代角质形成细胞。为从培养皿中解离亚融合状态的角质形成细胞，需移除培养基，用 1X PBS 洗涤细胞，然后向每孔加入 1 毫升预热的胰蛋白酶工作液。

在细胞培养箱中于 37 摄氏度孵育 15 分钟。充分重悬一个孔中的细胞，并将细胞悬液转移至含有 2 mL 含血清培养基的离心管中。用 3 mL 1× PBS 冲洗该孔一次，并将冲洗液加入含有细胞悬液的离心管中。

在580 × g条件下离心5分钟，弃去上清液。用5毫升1× PBS洗涤细胞，在580 × g条件下离心5分钟，弃去上清液。在15毫升聚丙烯管中，将1.6 × 10⁵个角质形成细胞重悬于1毫升CFAD培养基中。

为每种条件准备一种稀释液。三种整合缺陷型慢病毒（IDLV）载体已在前文文字方案中描述过，预先制备完成。IDLVTKSB 携带由 TET 调控的高活性 SB100X 转座酶。

IDLVrtTA 编码调控因子，IDLVT2 携带目的基因。本示例中，绿色荧光蛋白（GFP）位于转座子反向重复序列之间。根据本表所示，将慢病毒载体稀释于 1 毫升 CFAD 培养基中，并加入 20 微升聚凝胺（polybrene）。

一、二、三为不含载体的阴性对照。四和五含有IDLVTKSB和IDLVrtTA。六、七、八和九含有全部三种慢病毒载体。

将每种慢病毒载体稀释液加入对应的角质形成细胞悬液中，以转导悬浮状态的细胞。移除一天前已接受致死性照射且已收缩的3T3-J2饲养层细胞中的培养基，将转导后的角质形成细胞接种至其上。完成一个孔的转导后，继续进行下一个孔的操作。

在25摄氏度下孵育30分钟。然后将细胞转移至37摄氏度继续孵育6小时。6小时后，向每个孔中加入1毫升CFAD培养基。

向第五、第八和第九孔中加入一微摩尔的多西环素。将细胞放回37摄氏度培养箱中。随后，按照文本方案中所述处理各孔中的细胞。

进行流式细胞荧光分析时，必须使用小鼠单克隆 APC 标记抗饲养层抗体对第 3 天和第 6 天脱落的转导原代角质形成细胞进行标记，以将其与 3T3-J2 饲养层细胞区分开来。通过将 5% FBS、500 毫摩尔 EDTA 和 1× PBS 混合，为每个样本配制 4 毫升染色缓冲液。用 1 毫升染色缓冲液洗涤脱落的细胞。

在580 × g条件下离心5分钟，弃去上清液。在用于流式细胞术检测的试管中，将5 × 10⁴个细胞重悬于100 µL染色缓冲液中。加入2 µL抗Feeder抗体（稀释比例为1:50），充分混匀。

在避光冰上孵育30分钟。30分钟后，用2毫升染色缓冲液洗涤。以580 × g离心5分钟。

弃去上清液，并用200微升染色缓冲液重悬。使用配备蓝色激光、红色激光以及用于检测GFP和APC荧光的滤光片的流式细胞仪，获取APC和GFP信号。APC阴性细胞群体中GFP阳性细胞的比例代表已转导的角质形成细胞。

进行实时 PCR 时，在 96 孔板中设置三个重复反应，每个反应的终体积为 25 微升。每个反应体系包含 1 微升 cDNA、12.5 微升 2X 主混合液、1.25 微升 20X 探针混合液中的引物，以及 10.25 微升无菌水。按照以下 PCR 程序运行实时 PCR：95°C 预变性 10 分钟，随后进行 40 个循环，每个循环包括 95°C 变性 15 秒和 60°C 退火延伸 1 分钟，最后在 4°C 保存。

最后，按照文本方案中所述分析实时 PCR 数据。对转导了不同剂量转座子的调节载体并在有或无多西环素存在下处理的 HeLa 细胞进行表达分析，结果显示需要高剂量的两种 IDLV 才能显著诱导 SB100X 表达。在有或无调节载体存在下，对转导了转座子载体的 HeLa 细胞中 SB100X 表达进行定量分析，发现在多西环素存在时，其表达水平较背景高出八倍。

经转导携带转座子和调节因子载体的角质形成细胞中，转录调控的 Sleeping Beauty 系统也可用于原代细胞。SB100X 在这些细胞中的表达显示出比关闭状态高出15倍的激活水平。在角质形成细胞中进行的转座实验中，细胞被三种 IDLV 载体转导，并分别添加或不添加多西环素，结果表明，经多西环素处理的细胞中有12%在其基因组中稳定整合了至少一个拷贝的 GFP。

一旦掌握，原代细胞中的关键转导过程可在八小时内完成，流式细胞分析需两小时，若操作得当，表达分析可在三小时内完成。在进行该操作时，重要的是要记住优化用于转导原代细胞的载体剂量组合，以实现可诱导型Sleeping Beauty转座酶的更高表达水平。在此步骤之后，可进一步采用其他方法，如定量PCR和连接介导PCR，以回答更多问题，例如每细胞转座子拷贝数以及基因组整合位点分布等。

该技术问世后，为基因治疗领域的研究人员探索“睡美人”系统在临床相关细胞工程化中的应用铺平了道路。观看视频后，您应能充分掌握以下操作：首先，如何利用IDLV载体转导原代角质形成细胞；其次，如何通过多西环素诱导条件检测高活性转座酶的表达；最后，如何通过流式细胞术追踪转座过程。

请务必注意，操作病毒载体可能具有极高危险性，因此在进行这些操作时，应始终采取适当的预防措施，例如使用生物安全柜（BCL）来控制污染水平，并随身配备一次性耗材。