用于高效递送表观基因组编辑工具至人诱导性多能干细胞衍生疾病模型的慢病毒载体平台

慢病毒载体平台相较于最常用的载体平台具有显著优势，特别是因为慢病毒载体能够容纳较大的基因插入片段。因此，在递送CRISPR/Cas工具的应用中，慢病毒载体似乎是首选平台。该技术模拟了α-突触核蛋白表达的天然调控机制，而该机制受损时与疾病相关。

它能够在基因表达水平上进行精细调控，而非引起基因表达的剧烈变化。我强烈建议在筛选过程中使用多个向导RNA来验证该方法或类似方法的有效性，因为向导RNA的效率存在很大差异。

确定其存在的唯一方法是进行系统、全面的筛选与验证。所开发的系统可轻松适用于其他模型系统，例如包括啮齿类和非人灵长类在内的动物模型。这些后续实验可为未来的临床研究提供概念验证。

本次实验操作将由我实验室的高级职员Ekaterina Ilich博士演示，她主要负责本项目相关的慢病毒载体质粒的分子克隆实验步骤。她还将演示慢病毒载体生产中的关键步骤。此外，我实验室专注于将人诱导多能干细胞分化为具有病理相关性细胞的博士后Lidia Tagliafierro博士也将参与实验操作的演示。

她将演示建立用于评估α-突触核蛋白内含子1甲基化谱的关键步骤。Ahila Sriskanda 是我实验室的一名工作人员，专注于人源iPS细胞衍生的神经前体细胞的培养。首先，通过扩增载体中的 DNMT3A 片段，从 d-Cas9-DNMT3A-GFP 中获取 DNMT3A 催化结构域。

用BamH1限制性内切酶消化DNMT3A片段后，将其连接至携带d-Cas9的修饰型PBK-301载体的BamH1位点，并通过直接Sanger测序验证，以替换纯合的Meissen报告基因，获得含有GFP消化产物的d-Cas9-DNMT3A-P2A纯合Meissen质粒及含有FSC 1的质粒。采用凝胶纯化方法纯化载体片段。

通过用 FSC-1 酶切 PBK-201 来制备插入片段。将 FSC-1 片段克隆至载体中，以构建 d-Cas9-DNMT3A-P2A-GFP。用 0.2% 明胶包被 15 厘米培养皿用于转染，并静置 10 分钟。

然后吸除明胶，加入22.5毫升高糖培养基和2.5毫升预先培养的HEK-293T细胞悬液。将培养板置于37°C、5%CO₂条件下培养，直至细胞融合度达到70%至80%。为制备适用于115厘米培养皿的质粒混合物，请使用文中所述的四种质粒。

向含有质粒的同一支15毫升离心管中加入312.5 µL的一摩尔氯化钙，并用无菌双蒸水将终体积调至1.25 mL。在涡旋振荡的同时，缓慢逐滴加入1.25 mL的2× BBM溶液。室温孵育30分钟。

吸去细胞中的培养基，加入 22.5 毫升新鲜配制的无血清高糖 DMEM 培养基。将 2.5 毫升转染混合物逐滴加入每块培养板中。轻轻摇晃培养板，于 37°C、5%CO₂ 条件下孵育 2 至 3 小时；孵育后，每孔加入 2.5 毫升血清，使血清终浓度达到 10%，然后于 37°C、5%CO₂ 条件下过夜孵育。

收集病毒时，从所有转染的细胞中收集上清液，并将其合并至50毫升锥形管中。在室温下以400至450 ×g离心10分钟，然后通过0.45微米真空滤器过滤上清液。接下来，通过制备锥形超速离心管来构建蔗糖梯度。

将过滤后的上清液小心地加入梯度液中，将病毒上清液等量分配至各超速离心管中，每管填充体积至少达到四分之三。在17°C条件下，以70000 g离心两小时。轻柔收集30%至60%的蔗糖组分至洁净离心管中，加入冷的1×PBS缓冲液，使总体积达到100毫升，并反复吹打混匀。

向每支试管中小心加入 4 毫升含 20% 蔗糖的 1×PBS，以进行病毒制剂的密度分层，随后每管用移液器加入约 20 至 25 毫升病毒溶液。小心平衡试管，然后在 17°C 下以 70000 ×g 离心 2 小时。小心吸除残留液体，彻底去除所有液体，留下含有病毒的沉淀，这些沉淀通常仅表现为微小的半透明斑点，几乎不可见。

弃去上清液后，将离心管倒置于纸巾上，使残留液体充分沥干。向第一支离心管中加入70 µL 1× PBS，用移液器充分吹打以重悬沉淀。将悬液转移至下一管，重复吹打和转移操作，直至所有沉淀均被重悬。

向第一管中再加入 50 µL 1× PBS，混匀以进行洗涤。然后将悬液转移至第二管中进行洗涤，并按照前述方法继续洗涤和转移，最终得到约 120 µL 略带乳光的终末悬液。在 10000 ×g 离心 60 秒，获得澄清悬液后，将上清液转移至新管中，分装成每份 5 µL 的等份，于 -80 °C 保存。取一支含有 MD NPC 的冻存管，置于 37 °C 金属浴中加热 2 分钟，将解冻后的细胞转移至含 10 mL 预热的 DMEM-F12 培养基的 15 mL 圆锥形离心管中。

在300 ×g条件下离心5分钟。吸除上清液，并将细胞重悬于2毫升预热的完全N2B2培养基中。向细胞悬液中加入2毫升N2B27，然后将2毫升细胞悬液接种至先前准备好的BMM编码六孔板的每个孔中。

将细胞在37摄氏度、5% CO2条件下孵育过夜。当MD NPCs达到70%融合度时，加入两微升慢病毒引导RNA d-Cas9-DNMT3A载体进行转导，并轻轻摇晃培养板。转导后48小时，在相同条件下继续孵育16小时，然后更换N2B27培养基。

加入N2B27培养基，并添加5微克/毫升的纯Meissen，以获得稳定的MD NPC细胞系；在N2B27培养基中加入纯Meissen，培养细胞三周，以鉴定SNCA内含子1的甲基化谱型。首先使用DNA提取试剂盒从各稳定转导细胞系中提取DNA，然后取800纳克DNA，利用市售试剂盒进行亚硫酸氢盐转化，再将亚硫酸氢盐转化后的DNA稀释至20纳克/微升。进行焦磷酸测序分析时，在无核酸酶的离心管中配制PCR预混液，将反应板转移至热循环仪，并启动PCR程序。

使用30和溴化物染色，通过琼脂糖凝胶电泳对扩增子进行可视化分析，取两微升PCR产物进行检测。对于焦磷酸测序实验，使用亚硫酸氢盐转化后的非甲基化与甲基化DNA混合物以及焦磷酸测序试剂，具体操作详见论文描述。使用焦磷酸测序软件计算每个CpG位点的甲基化水平。采用本方案生成的Lentivirus d-Cas9-DNMT3A-GFP载体与Naive GFP载体的慢病毒物理产量相当。

这表明，优化后的载体骨架与优化的生产方案相结合，可实现较高的产量，且CRISPR-dCas9载体的转导效率更稳定。Lentivirus d-Cas9-DNMT3A-GFP载体的转导效率比Naive GFP载体低四倍，提示CRISPR d-Cas9-RNA的包装效率有所降低。Naive PURO载体的转导效率比d-Cas9-DNMT3A载体高五倍。这些结果通过使用Naive GFP和d-Cas9-DNMT3A-GFP进一步得到验证。

本文所述基于EB的方案可实现中脑神经前体细胞（MD NPC）的分化。hiPSCs表达多能性标志物Oct4，而中脑神经前体细胞则同时表达Nestin和FoxA2。针对SNCA内含子1区域的甲基化状态分析，共设计并验证了七种焦磷酸测序检测方法。

所有7种检测均经过验证，并显示出线性相关性；利用这些经过验证的检测方法，可以确定 SNCA 内含子1中23个CpG位点的甲基化水平。进行该实验时最重要的是使用生长状态良好且健康的细胞，以确保实验间结果的一致性。本演示中所强调的慢病毒载体的制备方法，可轻松应用于整合缺陷型抗病毒载体的生产，同时也可轻松放大以生成更大量或更高浓度的载体。该技术可为探索基因失调在年龄相关性神经退行性疾病（包括阿尔茨海默病及相关痴呆症）中的致病影响提供途径。

此处开发的慢病毒载体的优点在于其无危害性且不具备感染性，对细胞周期的影响极小，是一种安全可靠的基因治疗递送平台。