由人诱导多能干细胞生成标准化且可重复的前脑类脑器官

本实验的总体目标是从人类多能干细胞生成高度标准化且可重复的前脑类器官。该方法是研究新型发育机制的重要工具，尤其有助于解答与早期人类大脑皮层发生相关的关键科学问题。

该技术的主要优势在于能够以标准化且高效的方式生成人脑皮层组织，且不同类器官之间以及不同批次类器官之间的差异较小。类器官技术可为研究人脑的发育、结构和功能提供重要信息，尤其适用于探索在低等物种脑模型中不存在的那些特征。为了生成多能干细胞聚集体，当干细胞培养达到70%至90%融合度时，向六孔培养板的一个孔中加入500 µL细胞解离试剂以使细胞脱离。

经适应单层培养条件的诱导性多能干细胞是形成细胞聚集体的良好细胞类型，因为在解离和聚集体形成过程中，这类细胞较不易因应激而发生细胞死亡。在37摄氏度条件下轻轻敲击培养板5至10分钟，然后用2毫升DMEM/F-12培养基将细胞从孔底冲洗下来。将所得的细胞悬液转移至15毫升锥形管中，并用更多DMEM/F-12培养基将细胞悬液总体积补至10毫升。

计数后，将每份多能干细胞聚集体含 4.5 × 10³ 个细胞转移至新的 15 毫升离心管中，通过离心收集细胞。将细胞沉淀重悬于适量的多能干细胞培养基中，培养基中添加 50 µM ROCK 抑制剂，使细胞浓度达到每 150 µL 培养基含 4.5 × 10³ 个细胞。随后，将 150 µL 细胞悬液加入 96 孔低吸附 U 型底板的各个孔中，并将培养板置于 37 °C、5% CO₂ 的培养箱中孵育。

为监测前部神经外胚层诱导情况，每天应在低倍率下使用组织培养显微镜密切观察多能干细胞聚集体的形态变化。第1天应观察到边界清晰的细胞聚集体。第2天，小心吸出约三分之二的培养基，注意不要扰动各孔底部的细胞聚集体，并将弃去的培养基替换为100 µL新鲜的多能干细胞培养基。

四到六天后，当细胞聚集体直径达到 350 至 450 微米，并呈现光滑边缘时，使用经改造的 100 微升移液枪头，将最多 20 个聚集体转移至一个六厘米的低吸附培养皿中，该培养皿内含有五毫升皮层诱导培养基。每三天更换一次新鲜的皮层诱导培养基，并在 4X 物镜下每天观察聚集体的形态变化。在皮层诱导培养基中培养四到五天后，细胞聚集体的边缘表面应开始变亮，表明神经外胚层分化，并出现假复层上皮的放射状结构组织。

将神经外胚层聚集体包埋于基质支架中时，需先将基底膜提取物置于冰上解冻两至三小时。在提取物解冻过程中，使用无菌剪刀将塑料石蜡膜剪成每16个类器官对应一片4厘米×4厘米的正方形，将每片石蜡膜覆盖在空的100微升移液器吸头盒上。用戴着手套的指尖轻压石蜡膜，使其形成若干小凹陷，并用70%乙醇清洁石蜡膜表面。

在密闭的无菌生物安全柜中经紫外线照射30分钟后，使用经改造的100微升移液枪头（开口直径为1.5至2毫米）将每个细胞聚集体转移至薄膜中的一个凹孔内。当所有聚集体均转移完毕后，使用未剪切的100微升移液枪头小心吸出每个凹孔中的培养基，并向每个细胞聚集体中加入40微升未稀释的基底膜提取物。操作过程中应避免剧烈操作或将类器官吸入移液枪头内，以免损伤正在发育的神经上皮结构。

使用移液枪枪头将聚集体移至每滴液滴中央，用无菌镊子小心地将塑料石蜡膜片转移至一个10厘米的培养皿中。将培养皿放入培养箱中孵育15至20分钟。在提取物凝固的同时，向一个6厘米低吸附培养皿中加入5毫米新鲜皮层诱导培养基。

孵育结束后，将石蜡膜片翻转，用无菌镊子轻轻将最多16个已聚合的液滴转移至每个六厘米培养皿中。然后将类器官聚集体放回细胞培养孵育箱。次日，将类器官培养皿转移至细胞培养孵育箱内的摇床上，以每分钟14转、五度倾斜角持续摇动，并每日进行倒置显微镜观察，直至聚集体达到目标分化阶段。

第20天，使用经改造的、尖端开口为3至3.5毫升的一毫升移液器吸头，从聚集培养物中收集6个类器官。将其中3个类器官放入含有500微升PBS的24孔板的一个孔中，用5毫升移液器每次加入500微升新鲜PBS，洗涤类器官两次。第二次洗涤后，将类器官置于冰冷的4%多聚甲醛中固定15分钟，随后在室温PBS中洗涤三次，每次10分钟，最后在4摄氏度条件下于30%蔗糖溶液中过夜脱水。

第二天，用1:50的台盼蓝稀释液对脱水的类器官进行预染色，持续10分钟，以便在冷冻切片过程中观察类器官；随后将蔗糖替换为新配制的包埋介质。将培养板置于60摄氏度的加热板上加热15分钟，使类器官在包埋介质中充分平衡。每个类器官对应一个包埋模具，用新鲜的包埋介质覆盖其底部。将模具置于冰上使包埋介质凝固，然后将类器官转移至包埋模具中，并加入新鲜包埋介质，直至完全覆盖每个类器官。

然后将类器官置于100%乙醇与干冰配制的冷冻浴中速冻至少一分钟，随后使用冷冻切片机对每个类器官切取20 µm厚的切片，用于免疫细胞化学分析。为生成前脑型类器官，起始细胞群体中应仅使用呈现为未分化细胞均一单层的iPSC培养物。在第2天，细胞聚集体应已形成边缘光滑的致密细胞芽。

第10天的细胞聚集体外表面应呈现光滑且光学透明的组织，表明神经外胚层已成功诱导。若严格按照本方案操作，将获得高度标准化的类器官批次，其批内和批间极化神经外胚层形成的均一性可达90%或更高。第20天类器官的免疫细胞化学分析显示，存在分层的神经上皮样结构，表达神经干细胞标志物Sox2、前脑标志物Pax6和Otx2，以及背侧皮层标志物Emx1。

这些皮质样环状结构的特征还包括 N-钙黏蛋白和 ZO-1 在顶端的定位、由脑室区放射状胶质细胞衍生的微管结构，该微管从结构的顶端延伸至基底端，以及位于顶端且表达磷酸化波形蛋白的分裂细胞。为了分析顶端放射状胶质细胞的分裂平面，可对波形蛋白和 Tpx2 进行双重染色，Tpx2 是一种微管相关蛋白，可用于在核间期迁移过程中可视化有丝分裂纺锤体和顶端突起。观看本视频后，您应能够充分掌握如何从人多能干细胞中生成高度标准化且均一的前脑类器官。

该技术利用一种以神经组织特异性方式排列的复杂三维细胞模型，有助于研究神经发育障碍中的人类特异性特征。掌握该技术后，这些皮质类器官可应用于多种研究，如神经发育、进化或基因功能研究，包括疾病建模以及潜在的药物筛选或治疗研究。