基于显微镜的上皮细胞迁移评估方法 体外 伤口愈合

这些上皮细胞培养人工损伤实验的总体目标是从定量和定性两个角度研究细胞迁移，从而评估特定处理因素对伤口愈合的影响。该方法有助于回答伤口愈合领域中的关键科学问题，因为它能够精确表征特定迁移过程在上皮层破坏期间所起的作用。该方法的主要优势在于，能够将细胞迁移的测量结果与相关分子标志物行为变化进行关联分析。

这些技术的应用可延伸至临床伤口治疗领域，因其为早期药物筛选和伤口闭合研究提供了便捷的实验平台。通常采用该方法是由于在使用传统方法造伤时，难以获得一致且可重复的伤口模型。对于人工划痕伤口实验，首先在培养板的每个孔中加入两毫升含目标上皮细胞的完全培养基进行接种。

将细胞置于37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养两至三天，直至细胞融合度达到100%。当细胞准备就绪后，用新鲜的无血清培养基洗涤细胞两次，随后在新鲜的无血清培养基中继续培养24小时。次日，将培养板置于无菌操作区域，用无菌微量移液器吸头的细端在每个孔底部以十字交叉方式划线两次，以形成十字形伤口。

通过在上皮表面平稳移动枪头的同时施加恒定且稳固的压力，可获得一致的伤口间隙。压力过大将导致枪头变形，从而造成伤口半径不规则。轻轻移除上清液以去除脱落的细胞，并小心地向孔中加入新鲜的无血清培养基。

使用连接到电荷耦合器件相机的倒置相差显微镜，将显微镜视野边缘与划痕交叉处对齐，以在每个孔中获取最多四张划痕间隙的处理前参考图像。完成所有图像采集后，将指定处理孔中的培养基更换为新鲜培养基，并添加选定的处理因素，随后将培养板放回细胞培养孵育箱中。当至少一个条件达到约90%划痕间隙闭合时，轻轻弃去上清液，加入1毫升含4%多聚甲醛的PBS溶液，在室温下孵育15分钟。

然后用 PBS 轻柔洗涤细胞至少三次，以去除多余的甲醛，并使用与划痕后拍摄的原始参考区域相同的成像参数，对孔板进行成像，方法如前所述。为使用适当图像处理软件分析图像，请打开记录的处理前目标图像，在 Image 菜单下将图像类型设置为 8 位。在 Process 菜单下，选择 Filters 子菜单并应用方差滤波（Variance filtering）。

在“图像”菜单下，打开“调整”子菜单，将阈值设置为黑白。在“处理”菜单中，选择“二值化”子菜单并应用“填充孔洞”。在“分析”菜单下，选择“设置测量”并启用“面积”。

然后沿迁移边缘轮廓绘制可测量区域，以界定间隙。在“分析”菜单下，选择“分析颗粒”并记录所绘制区域表面的总面积值。通过间隙表面测量值的差异来量化每组独立样本的绝对迁移量，将处理前和处理后的总间隙表面积值导出至电子表格，并绘制量化结果图。

进行人工迁移前沿实验时，在无菌条件下，将最多33个已灭菌的圆形盖玻片铺于空的10厘米培养皿中形成单层。当培养皿表面完全覆盖后，以适当的浓度接种目标上皮细胞，使细胞在培养两至三天后达到100%汇合度。如有必要，可用无菌移液器吸头轻轻按压盖玻片，防止其漂浮。

当细胞达到汇合状态时，将上清液更换为无血清培养基，继续培养24小时。然后，使用无菌镊子小心地将一张盖玻片转移至一个新的含有新鲜无血清培养基的10厘米培养皿中，操作时应夹持盖玻片的边缘部分。为制造人工伤口，用灭菌的剃须刀片在每张盖玻片上来回拖动，于细胞培养层中央划出一条3至4毫米宽的横向划痕，以完全去除中央的单层细胞条带。

制作伤口时，务必用力将剃刀刀片边缘紧压在盖玻片表面，以防止产生不规则的边缘形状以及翻卷的上皮部分。将最多四片带有伤口的盖玻片（细胞面朝上）转移至六孔板的各个孔中，每孔加入至少两毫升无血清培养基，轻轻洗涤每个孔两次，每次使用新鲜的无血清培养基，以去除任何脱落的细胞。在弃去所有脱落细胞后，轻轻将洗涤用培养基替换为添加了目标处理因素的新鲜培养基，并将培养板放入细胞培养箱中。

在适当的实验周期结束后，按照前述方法使用含4%甲醛的PBS固定细胞，并用相应的荧光标记抗体对细胞进行染色。然后根据感兴趣的实验参数，通过荧光显微镜观察迁移前沿发生的结构变化。在本实验中，测量了表皮生长因子处理前后伤口间隙的大小，表皮生长因子是已知的上皮细胞增殖与迁移诱导剂。

绝对迁移量通过计算处理前后间隙表面面积的差值来确定。表皮生长因子处理可增强细胞骨架动力学，这一点在对照组和生长因子刺激细胞的F-肌动蛋白染色激光扫描显微图像中可见。此外，在迁移前沿相邻细胞中观察到c-Jun过表达，且该蛋白的表达水平明显升高。

在进行该操作时，重要的是要记得检查伤口边缘的完整性，观察是否存在可能干扰迁移定量的上皮细胞瓣。观看本视频后，您应能够充分理解如何对