细胞侵袭与迁移过程的评估：基于视频显微镜的划痕伤口实验与Boyden小室实验的比较

本实验的总体目标是报告并比较用于研究细胞侵袭和迁移的两种实验方法：Boyden 小室实验和一种优化的基于体外视频显微镜的划痕伤口实验。这些实验有助于回答侵袭与迁移研究领域中的关键问题，例如选择最相关的方法。这种优化的基于体外视频显微镜的划痕伤口实验的主要优势在于，它能够在不同处理条件下提供可重复且精确的比较。

尽管该方法可用于评估细胞迁移和侵袭能力，但也适用于其他研究领域，如伤口愈合或组织再生。在实验第一天前72小时，将SQ20B细胞以每175平方厘米培养瓶中接种2×10⁶个细胞的密度，接种于25毫升培养基中进行培养。在37°C条件下培养，使细胞生长至80%融合度。

在消化和细胞计数后的第一天，将细胞以每3毫升培养基中6×10⁵个细胞的密度接种至25平方厘米的培养瓶中，每种实验条件均需设置。将细胞在37°C下培养24小时。次日，通过将每个培养瓶中的培养基更换为3毫升低胎牛血清培养基，对细胞进行饥饿处理。

在37摄氏度培养箱中将细胞饥饿处理24小时。在细胞饥饿开始12小时后，准备包被的Boyden小室用于侵袭实验。将每个Boyden小室放入配套培养板中。

向每个包被的培养室中加入 500 微升饥饿细胞培养基。在次日，即第三天，使用配套培养板制备趋化因子。向 24 孔配套培养板的每孔中加入 750 微升含 10% FBS、氢化可的松、青霉素和链霉素的完全培养基。

将上室转移至预装好培养基的伴生板中，注意避免产生气泡。对于侵袭实验，小心地从每个Boyden小室中移除450微升培养基。在对饥饿处理的SQ20B细胞进行胰酶消化并计数后，将3 × 10⁴个细胞接种至500微升含0.1% BSA的培养基中，最终稀释浓度为每毫升6 × 10⁴个细胞。

将Boyden小室置于37摄氏度培养箱中孵育24小时。第4天，从配套培养板中取出每个插入式小室，用棉签小心去除上室中的细胞。随后，按照生产商说明书，使用染色试剂盒对每个插入式小室分别进行固定和染色，以获得瑞氏-吉姆萨染色结果。

在第五天进行显微镜分析。将含有插入物的配套培养板置于20倍相差显微镜下，计数膜下表面的每一个迁移细胞。在检测第一天前72小时，将2 × 10⁶个SQ20B细胞接种于175平方厘米培养瓶中的25毫升培养基中，让细胞生长至80%汇合度。

消化并计数细胞后的第一天，将SQ20B细胞配制成预稀释液，密度为每毫升4 × 10⁵个细胞。取100 µL细胞悬液加入96孔板的每个孔中，使每孔终浓度为100 µL中含有4 × 10⁴个细胞。将培养板置于37 °C培养箱中，孵育12至16小时，使细胞充分贴壁。

第二天，将培养板移至生物安全柜中，使用商用划伤装置进行划伤操作。取下划伤装置的上部，并将其置于清洗槽溶液中。将培养板插入底座板架中，并移除培养板盖。

通过将针块的后部定位销插入底板的后部孔中，来更换针块。按住并保持黑色杠杆向下，同时抬起针块，并在此过程中持续按住黑色杠杆。使用带有适配锥形吸头的移液器，立即从每个孔中移除培养基，注意不要触碰划痕区域。

向每个孔中加入100微升预热至37摄氏度的细胞培养基以洗涤细胞。第二次洗涤后，使用带有锥形吸头的移液器吸取细胞培养基。接着，向每个孔中加入100微升针对各处理条件的特定培养基，注意避免在孔中产生气泡。

将96孔板放入视频显微镜的适配架中。使用视频显微镜软件，设置扫描程序，每个孔采集一张图像。对于迁移侵袭实验，最长扫描间隔为两小时。

如果实验目的是生成视频，则建议采用最长30分钟的时间间隔。使用适用于每种细胞类型的细胞掩模，监测并检查细胞迁移，时间至少24小时，最长可达五天，以分析细胞迁移情况。为获得适用于每种细胞系的细胞掩模，需利用特定的细胞图像集合，通过软件生成细胞处理定义。

描记曲线并将数据导出至电子表格，用于分析和比较结果。为进行细胞侵袭实验，以与细胞迁移实验相同的方式接种 SQ20B 细胞，并将 96 孔板放入培养箱中孵育。在实验的第二天，制备细胞外基质。

使用前，在4°C条件下解冻基质至少12小时，并确保无可见的聚集物。将微量离心管置于冰上预冷5分钟。使用预冷至4°C的锥形吸头，在预冷的微量离心管中用冷却至4°C的细胞培养基稀释基质，以获得终浓度为300微克/毫升的溶液。

将含有预稀释基质的微量离心管置于4°C冰箱中保存。从培养箱中取出96孔板。在通风橱内，按照制造商说明书以及之前演示的方法，使用商用划痕工具制造伤口。

使用带有适配锥形吸头的移液器立即从每个孔中移除培养基，并注意不要触碰伤口。用 100 微升预热至 37 摄氏度的细胞培养基将细胞洗涤两次。第二次洗涤后，将培养板置于冰上五分钟，以平衡其温度。

从每个孔中移除冷的培养基，注意小心从孔的边缘吸取，避免触碰伤口。使用预先在4摄氏度冷却的锥形吸头，向每孔中加入50 µL预稀释的基质。将培养板放入37 °C培养箱中孵育30分钟。

30 分钟后，根据每种处理条件的要求，向每个孔中加入 100 微升的适配细胞培养基。将培养板放入视频显微镜的适配架中。随后按照细胞迁移实验所示的方法设定扫描程序并进行视频显微镜分析。

图示为细胞固定后Boyden小室膜的典型结果。次优的膜在膜的上侧存在细胞团簇，导致结果无法解读。相比之下，理想的膜在膜的下侧可见可计数的蓝色染色细胞。

划痕伤口实验的最佳结果由以下图像展示，分别为0小时、15小时和30小时的伤口愈合情况。高质量实验的标准包括：伤口呈线性、伤口区域内无细胞碎片、细胞汇合度适宜。如图A所示，90%汇合度是进行伤口愈合实验的最佳细胞密度。图C显示了细胞密度过低的示例，图B则显示了由于细胞沉淀洗涤不充分导致的细胞簇形成。

利用视频显微镜软件获得的伤口愈合的图形化表示，展示了四种处理条件下随时间变化的伤口细胞汇合度参数的定量结果。观察发现，联合处理显著降低了细胞迁移。观看本视频后，您应能够充分理解如何评估细胞迁移和侵袭过程。