邻苯二甲酸酯结合DNA适配体的筛选、表征及其在电化学适体传感器中的应用
2018年3月21日
一种实验方案 体外 介绍了特异性结合邻苯二甲酸酯类化合物的DNA适配体的筛选与表征，并包含了所选适配体在电化学适体传感器中的应用。
本实验的总体目标是筛选针对高度疏水性小分子的基团特异性DNA适配体，并利用所筛选的适配体开发一种高灵敏的电化学生物传感器。该方法有助于解决适配体筛选领域中的关键问题，即当靶标为高度疏水性分子时，如何进行基团特异性适配体的筛选与表征。尽管该方法最有价值的部分在于电化学生物传感器的构建，但其亦可用于目标物的检测。
这些生物传感器也应适用于我们的适体亲和力测定。开始反应时，向纯化的适体PCR产物中加入100微升无RNase的水。涡旋混合液，直至沉淀完全溶解。
λ核酸外切酶反应对盐浓度敏感，其产物应通过乙醇沉淀进行纯化，而非异丙醇。将适配体溶液5微升、RNase-free水11微升以及10×反应缓冲液2微升分别加入五个微量离心管中。向其中四个管子分别加入2微升RNase-free水，以及含有2、5、8和10单位λ核酸外切酶的RNase-free水溶液各2微升。
轻轻吹打混匀。将离心管在37°C孵育35分钟，然后在80°C孵育15分钟。随后将离心管置于4°C保存，并配制12%的非变性PAGE胶。
向每根试管中加入一微升上样染料和四微升无RNase的水。将混合物在天然PAGE凝胶中以150伏电压电泳45分钟。确定完全生成单链DNA所需的最低量λ外切核酸酶。
进行大规模反应以生成单链DNA。针对每个待检测的结合靶标，将10微升经平均功能化的DBP编码磁珠与500微升浓度为1微摩尔的DBP-1溶液在室温下孵育1小时，同时旋转。随后弃去上清液。
用200微升PAE结合缓冲液将磁珠洗涤四次，然后将磁珠重悬于10微升PAE结合缓冲液中。在PAE结合缓冲液中制备10微摩尔的结合靶标测试分散液。这是将疏水性靶标在PAE结合缓冲液中进行分散的良好方法。
为了确保文库的富集，通过亲和试验进行筛选。将10 µL编码为DBP-1的磁珠加入到110 µL每种靶标测试溶液中。混合物孵育1小时后，通过磁分离收集上清液。
将上清液稀释100倍，每份定量PCR使用3微升。通过将测试样品存在时释放的DBP-1数量除以仅在PAE结合缓冲液中释放的DBP-1数量，计算相对亲和力。在进行测量之前，合成并纯化基于DBP-1的巯基化核心序列探针和信号探针。
用无核酸酶水将巯基化探针和信号探针分别配制成100微摩尔的溶液。接着，使用粒径分别为1、0.3和0.5微米的氧化铝粉末及微纤维布，对直径为2毫米的金电极进行抛光，每种粉末各抛光5分钟，直至电极表面呈镜面状。每次抛光后，将电极在超纯水中超声处理5分钟。
将抛光后的电极浸入0.5摩尔的硫酸溶液中。以饱和甘汞电极为参比电极，在-0.4至+1.2伏特范围内，以100毫伏每秒的扫描速率连续进行35次循环伏安扫描以清洗电极。随后，在薄壁离心管中配制0.5微摩尔的硫醇化探针DBP-1混合液。
将0.5微摩尔的FC修饰的DBP-1溶于100微升PBS中。将混合物置于95摄氏度的水浴中加热10分钟，随后在水浴中冷却至室温。
向冷却后的混合物中加入1 µL的10 mM TCEP储备溶液，在室温下孵育1小时。随后将洁净的金电极浸入该混合物中，在室温下孵育12小时。用PBS冲洗电极，再将电极浸入含1 mM巯基化PEG的PBS溶液中，孵育1小时。
用不含靶标的 PAE 结合缓冲液彻底冲洗电极，并将电极浸入缓冲液中。随后，将铂对电极和饱和甘汞参比电极的电解池依次在超纯水和 PAE 结合缓冲液中各超声处理两分钟。打开方波伏安法仪器软件中的方波设置，输入实验参数。
用目标游离PAE结合缓冲液填充洁净的电解池。将三个洁净的电极连接至电化学工作站，并将电极浸入缓冲液中。采集背景方波伏安扫描曲线。
然后将金工作电极浸入含有10皮摩尔邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯（DEHP）的PAE结合缓冲液中，在室温下孵育30分钟。用PAE结合缓冲液彻底冲洗电极。将三个电极均浸入新鲜的PAE结合缓冲液中，并使用与之前相同的参数采集另一条方波伏安（SWV）曲线。
通过逐步增加DEHP的浓度重复此过程，以获得滴定曲线。根据小规模反应结果，获得单链DNA所需的λ外切酶最小用量为2个单位。适配体候选物DBP-1通过SELEX技术结合高通量测序鉴定获得。
DBP-1 对邻苯二甲酸酯类化合物表现出良好的组特异性。使用 DBP-1 的电化学适体传感器对邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯（DEHP）的响应具有选择性，不受其他常见环境污染物的干扰。该适体传感器对 DEHP 具有高灵敏度，最低可检测浓度低至 10 皮摩尔（10 picomolar）。
用于选择和表征危害性疏水小分子适配体的激光颗粒技术。由于邻苯二甲酸酯类（PAEs）等疏水小分子的水溶性极低且分子量较小，其适配体的表征与挥发性研究通常具有较大挑战性。观看本视频后，您应能够充分理解如何构建电化学适体传感器，以及如何利用该传感器检测目标物。
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概述
本文介绍了一种体外筛选和表征特异性结合疏水性小分子的类特异性DNA适配体的实验方案。此外，还讨论了这些筛选获得的适配体在电化学生物传感器开发中的应用。
关键研究组成部分
科学领域
- 生物化学
- 生物物理学
- 分析化学
背景
- DNA适体是能够与特定靶标结合的短单链DNA分子。
- 由于性质上的原因，疏水性小分子在适体筛选中带来了挑战。
- 电化学生物传感器为检测适体-靶标相互作用提供了一种高灵敏度的方法。
- 本研究旨在解决针对此类难处理靶标筛选适体的有效方法需求。
研究目的
- 建立一种用于筛选特定基团DNA适配体的实验方案。
- 表征这些适配体与疏水性分子之间的结合亲和力。
- 利用所筛选的适配体构建高灵敏度的电化学生物传感器。
使用的方法
- 通过系统进化进行DNA适配体的体外筛选。
- 适配体结合特性的表征。
- 用于检测的电化学适配体传感器的开发。
- 使用无RNase水配制适配体溶液。
主要结果
- 成功筛选出针对疏水性目标物的特异性DNA适配体。
- 验证了所筛选适配体的结合亲和力。
- 开发了一种可检测适配体-目标物相互作用的电化学生物传感器。
- 该方法为针对难处理目标物的适配体筛选提供了研究思路。
结论
- 该方案可有效筛选和表征针对疏水性分子的 DNA 适体。
- 可利用这些适体开发电化学生物传感器。
- 本研究有助于深入理解适体筛选方法学。
常见问题
行业重要性概述
邻苯二甲酸酯（PAEs）等疏水性小分子在发现阶段的检测受限于缺乏稳定且具有基团特异性的识别元件。本方案可实现对高度疏水性靶标DNA适配体的筛选与定量表征，有助于开发超灵敏电化学生物传感器。该方法可提升生物制药研发中与环境及安全性相关分析物的预测可靠性，并支持候选分子组合的优先级筛选。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 利用DNA适配体实现对疏水性小分子靶标的分组特异性检测。
- 通过提供适配体-靶标相互作用的定量亲和力与选择性数据，支持机制层面的风险评估。
- 促进适配体与结构相关邻苯二甲酸酯（PAEs）结合的功能验证，为靶标可信度提供依据。
筛选与检测方法开发
- 为下游生物传感器工作流程制备经过验证的适配体系统。
- 标准化竞争性结合实验，以实现可重复的亲和力和选择性测量。
- 支持针对特定类别的适配体候选分子的规模化筛选。
- 在生物传感器平台中提供定量输出，用于可靠地评估化合物。
转化与临床前研究
- 将适配体筛选与用于环境和安全监测的转化型生物传感器开发相结合。
- 支持从分子识别发现到临床前生物传感器验证的连续性研究。
- 降低适配体检测系统在法规申报或现场应用推进过程中的风险。
流程与工作流整合
该方法整合了从早期适配体筛选到生物传感器检测开发的全过程，实现了从靶点验证到临床前生物传感器准备的连续性。
- 发现生物学：为小分子识别中的假设验证和通路阐明提供平台。
- 筛选：提供适配体候选物的可重复、定量的亲和力与选择性数据。
- 分析：采用qPCR和竞争性实验，在不同邻苯二甲酸酯类化合物（PAEs）之间生成可比较的结合参数。
- 转化研究：将适配体发现与生物传感器应用相结合，服务于环境与安全检测终点。
- 企业级复用：建立可重复使用的流程，用于针对其他疏水性小分子的适配体筛选。
运营与企业影响
- 科学价值：提高小分子检测的预测置信度，降低机制上的不确定性。
- 操作价值：标准化适体筛选与生物传感器制备，实现可重复性与可扩展性。
- 战略价值：优化生物传感器研发管线中的决策流程，提升资本使用效率。
- 组合影响：实现基于适体检测平台的风险调整后优先级排序。
实施注意事项
- 需要具备适配体筛选、qPCR 分析和生物传感器制备方面的专业知识。
- 需要能够使用磁性分离、高通量测序和电化学仪器设备。
- 要求跨团队对结合和竞争性检测方法进行标准化。
- 对于溶解度低或功能化选择有限的其他疏水性目标分子，可能需要进行方法调整。
- 实际限制包括难以将高度疏水的目标分子固定用于筛选。
生物制药常见问题
Chapters in this video
0:04
Title
0:50
Small-scale λ Exonuclease Reaction
2:40
Relative Affinity and Specificity Test by Competitive Assays
4:17
Fabrication and Electrochemical Measurements of Diethylhexyl Phthalate (DEHP) Electrochemical Biosensors
7:52
Results: Optimization of λ Exonuclease Reaction and Electrochemical Aptasensor Evaluation
8:46
Conclusion
