基于适体的靶标检测结合三阶段G-四链体等温指数扩增反应
2022年10月6日
本方案展示了使用一种快速、三步式、基于适配体的指数扩增检测方法来检测目标物。涵盖了样本制备、信号扩增和显色发育步骤，以实现对该体系的应用，特异性识别茶碱而非咖啡因的存在。
该方法可将结合事件的信号放大，转化为可通过肉眼观察检测的信号，适用于低资源环境，也可使用基于吸光度的仪器进行定量。这是一种相对快速的单管操作流程，用于确定待测样本中适配体靶标的有无。若需定量，可将结果与标准校准曲线进行比较。
在转移和混合溶液时，操作者必须非常精确，因为混合不充分会导致阴性结果。同时，确保试剂和溶液在使用前始终保持低温，以尽量减少背景信号。首先，在PCR管中加入5单位的T4多核苷酸激酶，以激活核酶切割产物。
然后，向每个样品管中加入 1 微升预先配制好的 5X 核酶缓冲液。为了直观地展示特异性，向各测试样品管中分别加入 1.5 微升 2 毫摩尔的茶碱或 2 毫摩尔的咖啡因，并通过移液吹打 5 至 10 次使每个样品充分混匀。接着，向每个样品管中加入 2 微升含有靶标特异性适配体结构域的 600 纳摩尔 RNA，随后立即移液混匀各组分。
现在，将试管置于冷块上，以尽量减少背景信号。在准备好所有反应管后，将每个样品在室温下孵育，精确孵育三分钟。孵育结束后，立即将样品管放回冰上。
向每个样品管中加入 3.5 µL 的 nicase 聚合酶酶混合物，并充分混匀。然后，向每个样品管中加入 31.5 µL 含有模板核苷酸和反应缓冲液的 EXPAR 反应混合物，并通过移液混匀。所有样品制备完成后，将样品置于 55 °C 下孵育 5 分钟，并使用计时器控制时间。
孵育后立即将样品管放回冰上。向每个样品管中加入2 µL血红素溶液以显色，并充分混匀。然后，向每个样品管中加入58 µL市售的TMB溶液，充分混匀后孵育以进行显色。
通过肉眼定性读取样本，或按照文中的描述使用吸光度酶标仪对结果进行定量。优化后的构建体可在30分钟内识别低至500纳摩尔的茶碱。暴露于目标物的样本会呈现蓝色，而不含目标物的样本则保持无色。
根据显色30分钟后在A450处测得的信号绘制标准曲线。在不进行孵育时，应将样品置于冰上，因为即使经过优化的RNA仍会表现出较低的背景活性。
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概述
本方案展示了一种快速、三步式、基于适配体的指数扩增检测方法，用于检测茶碱等目标物。该方法包括样本制备、信号扩增和显色三个步骤。
关键研究组成部分
科学领域
- 生物化学
- 分析化学
- 生物技术
背景
- 适配体是能够与特定靶标结合的短单链RNA或DNA分子。
- 信号放大对于检测低丰度靶标至关重要。
- 可视化检测方法在资源有限的环境中具有优势。
- 精确操作试剂对于获得准确结果至关重要。
研究目的
- 建立一种快速检测茶碱而非咖啡因的方法。
- 提供一种用于信号放大的单管反应体系方案。
- 通过标准曲线实现结果的定量分析。
使用的方法
- 使用T4多核苷酸激酶激活核酶切割产物。
- 结合事件的可视化检测。
- 利用基于吸光度的仪器进行定量分析。
- 仔细混合并冷却试剂，以尽量减少背景信号。
主要结果
- 该方法可用于检测样品中的茶碱。
- 结果可通过视觉判读或进行定量分析。
- 溶液操作的精确性对成功结果至关重要。
- 通过合理的试剂管理可最大限度减少背景信号。
结论
- 基于适配体的检测方法是一种快速且有效的靶标检测手段。
- 该方法可适用于资源有限环境中的多种应用。
- 未来的研究可探索更多靶标及对实验方案的进一步优化。
常见问题
行业重要性概述
基于适体的检测系统结合等温指数扩增技术，可为早期发现工作流程中的靶标验证提供快速、灵敏且可通过视觉判读的结果。该三阶段G-四链体扩增方案支持定性和定量检测读出，有助于在检测方法开发和筛选关键节点做出可靠决策。该方法可提高对靶标结合及特异性的预测置信度，直接影响项目筛选和下游检测的准备工作。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 利用适配体的特异性，实现对分子识别事件的直接检测。
- 通过可视觉检测的信号输出，支持对靶标结合的功能性验证。
- 促进对靶标结合的快速评估，助力机制层面的风险排除。
- 通过区分高度相似的分析物，提高对靶标选择性的信心。
筛选与检测方法开发
- 提供标准化的单管反应体系，实现可重复的检测设置。
- 通过吸光度测量提供定量结果，用于可靠的化合物评估。
- 仅需最少的仪器条件，即可实现样本的快速筛选。
- 支持基于标准曲线的定量分析，用于检测方法的标准化。
转化与临床前研究
- 在适配体设计支持下，可望针对与疾病相关的生物标志物进行适应性开发。
- 通过可扩展的检测形式，实现从发现到临床前验证的连续性。
- 通过优化的实验方案降低背景信号，从而减少假阳性风险。
流程与工作流整合
该适体-EXPAR 系统适用于从早期发现到先导物鉴定的连续过程，为分子识别向定量检测方法开发的过渡提供了桥梁。
- 发现生物学：通过确认靶标的存在性和特异性，支持假设验证和通路阐明。
- 筛选：提供可重复的定量结果，适用于高通量或资源有限的环境。
- 分析：支持基于吸光度的测量和标准曲线生成，用于比较分析。
- 转化研究：若适配体特异性已确立，可适用于生物标志物检测。
- 企业级复用：实验方案具有模块化特性，通过替换适配体区域即可适配新靶标。
运营与企业影响
- 科学价值：提高靶点验证中的预测可信度，降低机制上的不确定性。
- 操作价值：通过快速、标准化且可扩展的方案简化工作流程。
- 战略价值：实现更快速的“推进/终止”决策，并支持资本高效的检测方法开发。
- 项目组合影响：提供可靠、定量的检测数据，支持基于风险调整的优先级排序。
实施注意事项
- 需要具备适配体设计和核酸操作方面的专业知识。
- 需要具备基本的分子生物学仪器设备以及用于定量的吸光度酶标仪。
- 要求精确的试剂操作和温度控制，以尽量减少背景信号。
- 通过修改适配体结构域，该方案可适用于不同目标分子。
- 必须进行仔细优化，以确保特异性并尽量减少假阳性结果。
