基于球体的三维细胞培养模型在头颈部鳞状细胞癌治疗测试中的应用

本体外方法的总体目标是生成三维细胞培养类球体，以用于头颈部鳞状细胞癌现有标准治疗或实验性治疗方案的测试。该方法有助于我们理解头颈部癌细胞在暴露于放射治疗或放化疗处理时的三维肿瘤生长特性。需要指出的是，原代肿瘤细胞的处理较为困难，且并不总能可靠地形成三维类球体。

演示该操作的是来自我们实验室的技术员 Sabina Schwenk-Zieger。在使用肿瘤样本的原代细胞时，将样本置于合适且无菌的表面上，用无菌的一次性解剖刀将其充分切割成非常小的碎片。在充分进行机械分离原代组织后，将其转移至含有胶原酶1和胶原酶2的试管中，在37摄氏度下孵育一小时。

接下来，使用70微米的Falcon细胞筛过滤该混合物，并用HBSS洗涤悬液。成功分离并充分洗涤后，将含有100万至200万细胞的悬液转移至T75细胞培养瓶中，在37摄氏度下培养至亚融合状态，最长可培养10天。在显微镜下确认肿瘤细胞的生长情况。

计数培养中的细胞。使用带有凹形圆底的超低吸附96孔板，将5,000个原代肿瘤细胞或1,000至2,000个中间细胞系细胞接种到每孔200至300 µL培养基中。随后，将细胞在37 °C条件下进行培养。

每隔一天更换一次培养基。更换培养基时注意不要用移液器吸走类球体。继续培养类球体，直至观察到三维的类球状细胞聚集体。

请注意，将出现不规则或多个类球体形成的孔排除在后续研究之外。随后，更换培养基为含有化疗药物和/或单克隆抗体的培养基，浓度按需设定。加入顺铂，浓度分别为 2.5、5 或 10 µM，或加入 5-氟尿嘧啶至浓度为 30 µM。

在此实验步骤中，在第6天、第10天和第16天对类球体进行数字拍照记录后，使用图形软件测量其大小。以520×g离心微孔板2.5分钟，弃去上清液。随后用1×PBS洗涤细胞，再次离心微孔板，然后弃去上清液。

接下来，向每支小瓶中加入 100 µL 酶法细胞解离溶液，使类球体溶解。随后，将培养板在 37 °C 条件下孵育 8 分钟。在显微镜下检查类球体是否成功溶解。

加入 100 微升 DMEM。接着，以 520g 离心 2.5 分钟。然后吸去上清液，并将细胞重悬于 100 微升 DMEM 中。

随后，如有必要，可进行商品化的比色法增殖检测，并使用ELISA读板仪读取结果。所有细胞系均可形成可靠的球状体，但在大小和检测时间上存在差异。原代细胞在超低吸附培养板中也能形成可重复的球状体。

Ki-67 染色显示，培养物周边区域的细胞增殖率明显高于中心区域，这模拟了实体黏膜肿瘤中常见的营养物质分布情况，此类肿瘤常出现坏死的核心。此处展示了多种化疗药物及放射治疗对类球体大小的影响。在顺铂治疗前给予 2 Gy 放射剂量，与单独使用顺铂相比，可显著减小类球体的体积。

随着从原代人细胞生成类球体技术的进一步建立，这一疗法测试概念得以实现。在肿瘤活检后，可生成类球体，并用于分子特征分析及治疗敏感性检测。我们已建立了一种可重复的方案，能够从细胞系和原代人肿瘤细胞的细胞悬液中生成可重复的类球体。

该多模态检测方法具有足够的灵敏度，可识别组间微小差异。未来，该检测可用于：第一，评估个体对标准治疗方案和实验性治疗方案的反应；第二，进一步表征新鲜标本中的肿瘤细胞。

第三，将治疗反应与分子模式相关联。利用原代细胞并生成球状体，可在保留体内肿瘤生长尽可能多特征的同时，结合一种成本效益高的检测方法，用于研究个体对治疗的反应。