功能性三维球状体细胞培养的半自动化表型分析

本方案展示了如何培养高度可重复的球状体，并说明如何开展蛋白质组学实验以表征三维结构的生物学功能。我们的三维培养技术可在同一生物反应器中同时生成数百个生物学重复样本，而液相色谱-质谱（LC-MS）方法可在单次实验中检测数千种蛋白质的丰度。本实验操作将由来自实验室的博士后Stephanie Stransky进行示范。

首先，取 HepG2/C3A 和 THLE-3 细胞悬液。计数细胞数量，并用完全培养基稀释细胞悬液，以获得100万个细胞，总体积不超过1.5毫升。用0.5毫升培养基洗涤超低吸附24孔圆底板的各孔，然后在3,000g离心5分钟。

将细胞悬液转移至培养板中，在120g条件下离心3分钟。随后孵育培养板以启动球状体形成。接下来，在转移球状体前24小时对生物反应器进行平衡：使用带长针的10毫升注射器，向湿度室中加入25毫升无菌水，并向细胞室中加入9毫升培养基。

然后，将生物反应器置于37摄氏度、含5%二氧化碳的三维培养箱中培养24小时。使用1毫升宽口吸头轻轻吹打类球体，使其从超低吸附培养板上脱离，并转移至组织培养皿中。为收集残留的类球体，用0.5毫升预热的生长培养基洗涤培养板，并将洗液转移至培养皿中。

使用光学显微镜评估类球体的大小、致密性和圆整度，以筛选出形态良好的类球体。将选定的类球体转移至装有五毫升新鲜培养基的平衡生物反应器中。随后，用新鲜培养基充满整个生物反应器。

将生物反应器置于3D培养箱中，并使用控制单元调节旋转速度。每两到三天用10毫升新鲜培养基替换10毫升旧培养基。每次更换培养基后均需调整旋转速度。

将类球体培养15天后，将其均分至两个新的生物反应器中。打开平板电脑上安装的3D应用程序，选择生物反应器并采集图像。作为替代方法，可在生物反应器后方放置黑色背景，并确保细胞培养腔内无光线反射。

尽可能靠近生物反应器的位置拍摄图像。然后，使用连接在长针头上的注射器通过顶部端口从生物反应器中取出五毫升培养基，以收集球状体。确保球状体沉降至生物反应器底部中央。

现在，打开前部端口，使用1毫升宽口吸头收集球状体。将这些球状体转移至微量离心管中，在500×g下离心5分钟，并弃去培养基。通过加入200 µL HBSS洗涤球状体，以去除胎牛血清（FBS）。

此后，在500g条件下离心5分钟，并弃去上清液。然后迅速将球状体沉淀浸入液氮中冷冻，并将此冷冻沉淀于-80摄氏度保存，直至进一步处理。为裂解细胞，取一管收集好的球状体，将其重悬于25微升5% SDS中。

通过移液吹打重悬沉淀。接下来，将一微克样品与10微升0.1%三氯乙酸溶解。在提取蛋白质并净化样品后，设置质谱采集方法，以从鉴定出的肽段信号生成二级质谱（MS/MS）图谱。

然后，将样品板转移至纳升级液相色谱自动进样器中。在Orbitrap中设置全扫描质谱的质荷比范围为300至1,100。将分辨率调整为120000，并将自动增益控制目标值设为125。

然后，在Orbitrap中设置串联质谱（MS/MS），采用50质荷比的连续隔离窗口。将自动增益控制目标值设为400，并设定30的高能量碰撞解离能量。根据球状体的活力分析，腺苷酸激酶水平持续升高至第17天，导致约7%的细胞死亡。

随后，死亡率下降至5%以下。此外，对第一主成分的分析显示，球状体样本与平面细胞培养物之间存在明显差异。蛋白质组学分析表明，THLE-3和HepG2/C3A球状体具有相似的表达谱，反映了肝脏功能特征。此外，与平面培养细胞相比，球状体中两种金属硫蛋白亚型呈现过表达。

功能分组的网络显示，在 HepG2/C3A 和 THLE-3 球体中，碳水化合物代谢过程的基因本体富集。为避免培养基溢出，当细胞室完全充满液体时，切勿打开或关闭前部端口。本方案中所述的样品制备与分析可用于利用二维和三维方法探索细胞培养物以及组织样品的蛋白质组。