利用化学偶联方法对戊型肝炎病毒纳米颗粒进行表面功能化
2018年5月11日
我们已将戊型肝炎病毒的衣壳蛋白设计为一种诊疗一体化的纳米颗粒（HEVNP）。HEVNP 在黏膜递送过程中可自组装成稳定的二十面体笼状结构。本文描述了通过将表面暴露的残基突变为半胱氨酸，从而对 HEVNP 进行改造以实现肿瘤靶向的方法，这些半胱氨酸可偶联能够特异性结合肿瘤细胞的合成配体。
对HEV纳米颗粒表面进行化学功能化的总体目标是提供一种可重复且一致的方法，将靶向性免疫原、治疗性和诊断性分子偶联到HEV纳米颗粒表面，用于疾病的诊断和治疗。
该方法有助于回答纳米医学领域的一些关键问题，例如如何监测癌症的增强靶向性以及纳米治疗药物的分布情况。该技术的主要优势在于，与基因工程相比，它具有高度可重复性、高效且更容易实现。
演示实验步骤的是来自我们实验室的研究助理 Michelle Nguyen 和 Ivan Ruiz。
按照文本方案中所述，首先进行戊型肝炎病毒纳米颗粒的制备与纯化。
使用10毫摩尔MES缓冲液（pH 6.2）将HEV纳米颗粒样品稀释至每毫升0.5至2毫克，用于透射电子显微镜成像。将碳膜载网置于40毫安的辉光放电条件下处理30秒，以产生亲水性碳表面。载网的亲水性碳表面在辉光放电处理后仅能维持30分钟。离子化处理后，用镊子夹持载网，向载网上滴加2微升HEV纳米颗粒样品。
15至30秒后，用滤纸吸去载网上的液体。然后立即用双蒸水洗涤载网，并再次用滤纸吸干。立即向载网上加入2微升2%的醋酸铀酰溶液。15秒后，用滤纸吸去载网上的染液。将载网样品置于电子防潮干燥柜中过夜，使其干燥。
根据样品的不同，可能需要采用冷冻电子显微镜（cryo-EM）进行结构的可视化与表征。将载网转移至透射电子显微镜（TEM）中，在10至80K倍数下进行成像。由于缺乏病毒RNA，HEV纳米颗粒在TEM下呈现为空心的二十面体蛋白结构，直径约为27纳米。
为进行HEV纳米颗粒与马来酰亚胺连接的生物素的一步偶联，首先将HEV纳米颗粒加入微型透析装置中。根据生产商说明书，在室温下用0.01摩尔PBS缓冲液（pH 7.4）对纳米颗粒透析1小时。透析完成后，将HEV纳米颗粒转移至1.5毫升离心管中，并使用分光光度计在280纳米处测定蛋白浓度。将纳米颗粒配制成1毫克/毫升的浓度，与等体积的100微摩尔马来酰亚胺-生物素溶液及0.01摩尔PBS缓冲液（pH 7.4）混合，使摩尔比为1:5。在4摄氏度反应过夜后，按照生产商说明书，使用离心脱盐柱去除未结合的马来酰亚胺-生物素。通过标准还原SDS-PAGE对样品进行分析。
按照标准操作流程，使用HRP标记的链霉亲和素制备化学发光Western印迹，并通过X射线胶片捕获化学发光信号。
为了将乳腺癌细胞特异性配体LXY30通过两步法偶联至HEV纳米颗粒表面暴露的半胱氨酸，首先将纳米颗粒加入微型透析装置中，在室温下用0.01摩尔PBS缓冲液（pH 7.4）透析一小时。然后将HEV纳米颗粒转移至1.5毫升离心管中，使用分光光度计在280纳米处测定蛋白浓度。接下来，将650微摩尔马来酰亚胺-叠氮化物与650微摩尔炔烃-LXY30混合，并加入200微摩尔硫酸铜和1毫摩尔抗坏血酸。该反应体系在4摄氏度下孵育过夜，生成650微摩尔的马来酰亚胺连接的LXY30。次日，将HEV纳米颗粒调整至浓度为1毫克/毫升，加入约10%体积的马来酰亚胺连接的LXY30，使摩尔比达到1:3，于4摄氏度反应过夜。由于马来酰亚胺-LXY30的初始浓度相对较高，混合后反应物（如硫酸铜）的终浓度被稀释约10倍。为避免这些成分对戊型肝炎病毒纳米颗粒造成损伤，另一种选择是采用无铜点击化学偶联方法。
根据制造商的说明书，使用离心脱盐柱去除未结合的马来酰亚胺点击化学试剂LXY30。将连接有LXY30的HEV纳米颗粒置于4摄氏度保存。为实现LXY30 HEV纳米颗粒与Cy5.5荧光标记的一步法偶联，首先将LXY30连接的纳米颗粒调整至1毫克/毫升浓度，并与等体积的Cy5.5荧光标记物混合，使摩尔比为1:5。将混合物在4摄氏度反应过夜后，根据制造商的说明书，通过离心脱盐柱步骤去除未结合的Cy5.5 NHS。将连接有LXY30和Cy5.5的HEV纳米颗粒置于4摄氏度保存。
为实现LXY30对HEV纳米颗粒的肿瘤细胞靶向功能化，尝试了两种方法。当HEV 573C纳米颗粒首先与马来酰亚胺叠氮结合，再通过点击化学反应连接LXY30炔基时，透射电子显微镜（TEM）观察显示HEV 573C纳米颗粒发生解体。然而，若先通过点击化学反应将LXY30-炔基与马来酰亚胺-叠氮连接形成马来酰亚胺连接的LXY30，再将其偶联至经修饰的HEV纳米颗粒，则未影响其结构，HEV 573C纳米颗粒保持完整。将LXY30和Cy5.5标记的HEV纳米颗粒应用于培养的乳腺癌细胞，并通过共聚焦显微镜观察。共聚焦显微镜的近红外荧光图像表明，与仅连接Cy5.5的HEV纳米颗粒相比，LXY30-Cy5.5连接的HEV纳米颗粒在MDA-MB-231乳腺癌细胞中表现出更高的结合亲和力和更强的内化能力。
该技术的应用前景包括多模式靶向和治疗分子的研究，这些分子能够精确定位肿瘤并进行诊断，同时不会对正常细胞造成损伤。尽管该方法可通过化学表面修饰来揭示癌症及肿瘤靶向机制，但它还可应用于早期癌症诊断、筛查以及影像引导下的治疗。
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概述
本研究介绍了将戊型肝炎病毒衣壳蛋白设计成一种用于靶向肿瘤治疗的诊疗一体化纳米颗粒（HEVNP）。通过偶联合成配体，对HEVNP进行修饰以增强其肿瘤靶向性。
关键研究组成部分
科学领域
- 纳米医学
- 诊疗一体化
- 肿瘤学
背景
- HEVNPs 可自组装成稳定的结构。
- 对纳米颗粒进行修饰可提高其靶向能力。
- 了解治疗药物的分布对于癌症治疗至关重要。
- 与传统的基因工程方法相比，该方法效率更高。
研究目的
- 建立一种用于功能化HEVNPs的一致性方法。
- 利用合成配体增强对癌细胞的靶向性。
- 促进肿瘤的诊断与治疗。
使用的方法
- HEV 纳米颗粒的制备与纯化。
- 用于成像的 HEVNP 样品稀释。
- 配体与表面暴露的半胱氨酸残基的偶联。
- 利用透射电子显微镜（TEM）进行分析。
主要结果
- HEVNPs 可被有效修饰以实现肿瘤靶向。
- 该偶联方法具有可重复性和高效性。
- 已证实对癌细胞的靶向能力得到增强。
- 突出了其在诊断和治疗中的潜在应用。
结论
- HEVNPs 代表了一种有前景的癌症治疗平台。
- 表面修饰可实现治疗剂的靶向递送。
- 该方法有望推动纳米医学领域的发展。
常见问题
行业应用价值
病毒样颗粒的化学表面功能化可在无需基因改造的情况下，实现靶向配体和成像剂的模块化与可重复偶联，从而支持诊疗型纳米载体的快速原型构建。该方法通过在稳定的纳米颗粒支架上系统性筛选多种生物分子，提高了靶点验证的预测可靠性。该技术解决了发现阶段的一个关键难题：在下游肿瘤学应用中，实现功能性分子的一致性和可扩展性展示。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：通过在HEV纳米颗粒上精确展示LXY30等肿瘤靶向配体，实现对治疗假设的验证。
- 操作价值：利用半胱氨酸定向偶联技术，提供一种可重复的配体-受体相互作用评估平台。
- 预测价值：通过在癌症细胞模型中快速比较配体亲和力和内化效率，支持候选分子组合的优先筛选。
筛选与检测方法开发
- 科学价值：生成具有确定配体密度的可定量纳米偶联物，用于标准化的结合和摄取实验。
- 操作价值：实现纳米颗粒功能化的批间一致性，对实验可重复性至关重要。
- 可扩展性：支持制备经验证的生物系统，用于靶向基团的高通量筛选。
转化与临床前研究
- 转化连续性：制备出靶向肿瘤的HEVNPs（LXY30-HEVNP-Cy5.5），并在乳腺癌细胞模型中得到验证，支持其推进至临床前研究。
- 机制性风险降低：证明通过点击化学预先形成马来酰亚胺连接的LXY30可保持纳米颗粒完整性，降低结构失效风险。
- 疾病相关体系：采用MDA-MB-231细胞评估内化效率和结合亲和力，与三阴性乳腺癌的治疗相关性一致。
流程与工作流整合
该方法适用于从靶点验证到先导化合物筛选的发现连续过程，能够制备功能化纳米载体用于临床前评价。
- 发现生物学：通过将免疫原性、治疗性和诊断性分子模块化地偶联至HEV纳米颗粒，支持假设验证。
- 筛选：提供可直接用于检测的纳米颗粒，具有可重复的表面修饰，可用于定量评估靶向效率。
- 分析：通过透射电子显微镜（TEM）、蛋白质印迹（Western blot）和共聚焦显微镜生成可测量的输出结果，以比较偶联效果和细胞摄取情况。
- 转化研究：通过在培养的癌细胞中展示肿瘤特异性结合与内化，实现从发现到临床前研究的衔接。
- 企业级复用：建立可重复使用的偶联平台，适用于其他具有已知结构的大分子复合物。
运营与企业影响
- 科学价值：通过精确的半胱氨酸特异性配体展示，增强靶点验证的可信度，同时不改变纳米颗粒的组装。
- 操作价值：与基因工程相比，具有更高的可重复性和效率，降低批次间的变异性。
- 战略价值：通过在稳定的纳米载体上快速筛选配体和成像标记物，提升“推进/终止”决策的准确性。
- 项目组合影响：通过生成具有已验证肿瘤靶向和成像能力的诊疗一体化候选分子，促进基于风险评估的项目推进。
实施注意事项
- 需要具备蛋白质化学、偶联技术及纳米颗粒纯化方面的专业知识。
- 依赖透析装置、分光光度法、SDS-PAGE、Western blotting 和共聚焦显微镜等设备的可及性。
- 需在不同团队间建立标准化流程，以确保蛋白质浓度测定和反应条件的一致性。
- 当将该方法应用于具有不同表面暴露残基的其他纳米颗粒体系时，需考虑适应性调整。
- 存在实际局限性，例如若偶联顺序未优化，则可能导致纳米颗粒解体，如过早的马来酰亚胺-叠氮结合所导致的情况。
生物制药常见问题
Chapters in this video
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Title
0:50
HEVNP Characterization
2:46
Chemical Conjugation of HEVNPs with Biotin, Cancer Targeting Ligand, and Fluorophores
7:05
Results: Production of LXY30-HEVNPs and Binding/Internalization of Fluorescently Labeled LXY30-HEVNPs in MDA-MB-231 Breast Cancer Cells
8:35
Conclusion
