基于展示SARS-CoV-2受体结合域的外膜囊泡的“即插即用”纳米颗粒疫苗平台

纳米科学可通过将抗原展示在载体表面，有效增强抗原特异性免疫反应。该疫苗平台的主要优势在于能够实现抗原的脱离与展示。换句话说，该平台能够展示多种抗原。此方法也可应用于其他生物纳米颗粒，以实现向纳米级载体的抗原展示。进行Cytolysin A Spy导管转化时，首先向50微升BL21感受态菌株中加入5微升质粒溶液。

轻轻吹打后，在冰上冷却30分钟。将溶液置于42摄氏度水浴中90秒，然后立即转移到冰上孵育3分钟。向细菌悬液中加入500 µL LB（Luria Bertani）培养基，混匀后于37摄氏度、220 rpm条件下培养1小时。

接下来，将所有转化产物接种到含有氨苄青霉素的LB琼脂平板上，并在37摄氏度下过夜培养。对于OMV SpyCatcher的生产，首先从平板上挑取单菌落接种至20毫升LB培养基中，在37摄氏度、220转/分钟的条件下过夜培养。将菌液转接至2升培养基中，在37摄氏度、220转/分钟的条件下继续培养5小时，直至达到对数生长期。

加入异丙基-β-D-异硫氰酸酯（IPTG），使细菌溶液的终浓度为 0.5 毫摩尔，并在 25 摄氏度、220 转/分钟条件下过夜培养。接着进行 OMV spycatcher 纯化。首先将细菌溶液进行离心。

用 0.22 微米膜过滤器过滤上清液，然后使用中空纤维柱进行浓缩。将浓缩液通过 0.22 微米膜过滤器再次过滤，随后在 4 摄氏度条件下以 150,000 ×g 离心 2 小时，使用超速离心机去除上清液。用 PBS 重悬沉淀物，并于 -80 摄氏度保存。

进行RBD spytag转染时，首先选择合适的真核表达系统，在复苏后于37摄氏度、130转/分钟条件下培养细胞过夜。取20微升HEK 293F细胞溶液加入自动细胞计数仪中，记录细胞数量，并将浓度调整至每毫升1×10⁶个细胞。

然后在37摄氏度、130转/分钟的条件下培养细胞4小时。将RBD spy tag质粒通过0.22微米膜过滤器过滤，并向细胞培养基中加入300微克质粒，直至终体积为10毫升。振荡10秒。

将PEI在水浴中加热至65摄氏度。取0.7毫升PEI与9.3毫升细胞培养基混合，间歇震荡10秒。将质粒溶液加入PEI溶液中。

间歇振荡混合物10秒，于37°C孵育15分钟。将混合物加入280毫升细胞培养基中，在37°C、130转/分钟条件下培养5天。随后进行RBD spytag纯化。

以6,000 × g在25°C下离心细胞20分钟，然后用移液器收集上清液。用2毫升镍-NTA琼脂糖填充层析柱，并用PBS洗涤三次。向细胞上清液中加入咪唑，使其终浓度为20 mmol/L，然后将细胞上清液上样至层析柱中。

加入三倍柱体积含 20 毫摩尔咪唑的 PBS 进行洗涤，并收集洗涤组分。用三倍柱体积含低至高浓度咪唑的 PBS 进行梯度洗脱，每个浓度洗脱两次。采用 BCA 法测定蛋白浓度时，将标准 BSA 蛋白溶液从 2 毫克/毫升至 0.0625 毫克/毫升进行系列稀释，将纯化的 OMV spycatcher 和 RBD spy tag 样品各稀释 10 倍。

然后按50:1的比例混合BCA工作液A和B。加入稀释后的蛋白质溶液，并与BCA工作液混匀。37摄氏度孵育30分钟。

测定每个孔在562纳米处的吸光度，并根据标准曲线计算蛋白质浓度。为进行OMV spycatcher与RBD spy tag的生物偶联，将OMV spycatcher、RBD spytag和PBS按40:1的比例混合。在4摄氏度下，以每分钟15转的速度垂直旋转混合物过夜。

使用 PBS 溶液通过类似于 OMV spycatcher 纯化的方法对 OMV RBD 进行纯化。质粒设计示意图显示，spycatcher 基因通过柔性连接子与 clyA 基因相连，而 spytag 则通过一个用于纯化和验证的 hys tag 基因连接至 RBD 基因的 5' 末端。超速离心后，几乎所有未反应的 RBD spytag 均保留在上清液中。

第二次超速离心并未比第一次带来进一步的显著优势。OMV spycatcher 的 z 平均流体动力学直径为 133 纳米，而 OMV-RBD 为 152.6 纳米。这些差异可能是由于 RBD 在大量展示后增加了 OMV 颗粒的尺寸。

透射电子显微镜（TEM）的结果与动态光散射（DLS）测得的粒径分布结果一致。混合物搅拌时的旋转操作至关重要。若不进行旋转，反应效率可能会显著降低。