小鼠脂肪组织采集与RNA分析前处理

本实验的总体目标是从不同小鼠中充分采集白色脂肪组织样本，并从组织中分离出大量高质量的RNA。该方法可用于解答代谢学、生物化学和分子生物学领域中的关键问题，例如经处理或基因修饰小鼠脂肪组织中的基因表达情况。该技术的主要优势在于，它能够从通常RNA含量较低的脂肪组织中分离出大量高质量的RNA。

演示该操作的是来自我实验室的研究助理 Emilie Pepin。在处死小鼠后，按照文本方案沿腹白线切开皮肤，然后从胸廓中部向右前肢方向以及靠近右后肢上方的生殖器官附近各做一条长约两厘米的切口。拉伸打开后的一角皮肤，并用22号针头将其固定在垫上。

然后，固定住另一个角。将手术剪尽可能平贴于皮肤，进行腹部皮下脂肪（SCF）的钝性分离，随后将其转移至预先剪好的铝箔片上。对动物左侧重复上述分离操作。

然后，将左右两侧收集的脂肪垫一同放入铝箔中，并使用液氮冷冻样品。为了获取内脏脂肪组织，沿腹白线切开腹肌。接着，从生殖器部位向小鼠背部方向，在两侧腹肌上分别做切口。

生殖器官周围的脂肪称为性腺周围脂肪（perigonadal fat，PGF）。将左右两侧的脂肪垫从附睾、睾丸和输精管上分离下来，转移至预先标记好的铝箔中，随后将样品置于液氮中冷冻。

从左侧开始，将肠道移向右侧腹腔，以暴露肾脏。此处可见围绕肾脏和肾上腺的脂肪组织为肾周脂肪（perirenal fat，PRF）。在收集PRF之前，先分离并去除肾上腺。

这一步可能较为繁琐，因为 PRF 略微比脂肪组织更偏粉红色。接下来，从背部肌肉壁上分离 PRF，并切断输尿管、肾动脉和肾静脉，从而将 PRF 和肾脏与身体其余部分分离。随后，通过切开并去除肾包膜，将 PRF 与肾脏分离。

分离出右侧PRF后，将样本连同左侧组织一起转移至铝箔上，并用液氮冷冻样本。根据文本方案，将1.5毫升无RNase的锥形管、研钵、研杵和刮勺预先在液氮中预冷。将脂肪组织样本放入研钵中，然后用几层牛皮纸将研杵从液氮中取出，并将其插入研钵中。

用纸握住研杵的同时，使用锤子敲击研杵顶部一至两次。接着，以旋转动作研磨样品，直至获得细粉。然后，取出研杵，从液氮中取出刮勺，并用其将样品转移至相应预冷的 1.5 毫升锥形管中。

不时将刮勺重新浸入液氮中，以防止样品融化。同时，将锥形管置于干冰上，以防止样品解冻。为获得足够的RNA产量，将研磨后的样品填充至锥形管约2/3的容量。

然后，根据文本方案制备其余样品。在化学通风橱内操作，并穿戴实验服、手套和护目镜，从液氮中取出一份研磨后的样品。缓慢打开离心管，加入 500 µL 苯酚溶液。

盖上离心管盖，最大速度涡旋约五秒钟，然后缓慢而小心地打开离心管以释放氮气压力。此时可听到气体从管中逸出的声音。用移液器向管中再加入500 µL酚溶液。

然后，涡旋混匀并像之前一样缓慢打开。涡旋样品直至完全溶解。随后，在处理其他样品前打开管盖以释放压力。

所有样品处理完毕后，在最大转速下短暂涡旋振荡，并在室温下孵育5分钟。在4°C、12,000 ×g 条件下离心10分钟。然后将离心管恢复至室温。

为避免污染，针对每个样本，使用带滤芯吸头的P1000移液器，从管壁附近刺穿脂质层，尽可能从中间的粉红色层中分离出RNA。将RNA转移至新的离心管中时，避免触碰管壁，以防将吸头外表面附着的脂质带入。向每个样本中加入200 µL纯氯仿，然后通过倒置混匀管子15秒。

随后，将样品在室温下孵育10分钟，然后在4°C条件下以12,000 × g离心15分钟，并将离心管重新放回室温。对于每个样品，使用P1000移液器和滤芯吸头，尽可能多地将含有RNA的透明水相上层转移至对应的第二组锥形管中。接着，向每个样品中加入500 µL的100%异丙醇，并通过倒置混匀15秒。

然后，将样品在室温下孵育10分钟。在4°C条件下以12,000 × g离心10分钟，随后将离心管恢复至室温。通过倾倒弃去异丙醇。

现在，向每个样品中加入 1 毫升 75% 乙醇，并在最大转速下短暂涡旋振荡试管。然后，在 7,500 ×g 和 4°C 条件下离心 5 分钟。离心结束后，将样品恢复至室温，通过倒置每根试管并轻轻敲击棕色滤纸以去除残留的 75% 乙醇。

打开管盖，将RNA沉淀在室温下晾干约15至20分钟。根据RNA沉淀的大小，向每个样品中加入10至25微升无RNase的水。将样品置于60摄氏度的加热块中孵育5分钟。

然后，短暂涡旋振荡各管。将样品在同一加热块中再孵育5分钟。随后，迅速离心所有样品，并立即置于冰上。

根据文本方案对脂肪组织中的基因表达进行RT-PCR检测。与正常饮食的小鼠相比，高脂饮食小鼠的体重和体重增加均显著升高。这些变化伴随肥胖小鼠的PGF、PRF和SCF重量较正常饮食小鼠增加两倍以上。

该表格显示，对于每种白色脂肪组织，使用苯酚溶液进行RNA提取所获得的样品，其OD260与OD280的比值约为2.0，表明RNA纯度较高。如本柱状图所示，实时PCR结果显示，与正常饮食小鼠相比，肥胖小鼠的PGF、PRF和SCF组织中瘦素（leptin）mRNA的表达水平显著升高。瘦素mRNA表达水平的差异并非由于用于两组小鼠结果归一化的参考基因s16发生变异所致，因为CT值未发生改变。

一旦掌握，若操作得当，该技术可在四小时内完成。在进行此实验过程中，需特别注意在RNA提取步骤中始终于无RNase的环境中操作。完成本实验后，可进一步采用其他方法（如实时PCR扩增）来回答更多科学问题，例如基因表达的改变。

该技术建立后，为代谢领域研究人员探索与肥胖症和糖尿病相关的啮齿类动物脂肪组织调控机制开辟了道路。观看本视频后，您应能够充分掌握如何分离不同脂肪垫并从中提取RNA。请注意，使用苯酚溶液具有极高危险性，操作过程中务必采取佩戴实验服和手套等防护措施。