一种可从新鲜冷冻小鼠骨组织中获得高质量RNA的激光捕获显微切割方案

您是否曾考虑过利用激光显微切割技术，在天然微环境中对特定骨细胞的基因表达进行分析？本文介绍了一种可从鼠骨冷冻切片中获取足量高质量RNA的实验方案。该技术是研究基因工程小鼠模型或疾病模型中特定骨细胞基因表达变化的有力工具。

本文所述方案主要针对小鼠骨骼，但也可用于研究任何物种中任何硬组织细胞内的原位基因表达。我实验室的技术员 Christiane Schueler 将协助演示该操作流程。在全身麻醉下通过放血法处死小鼠后，迅速取出完整的股骨。

使用手术刀和纸巾清除股骨周围的软组织。接着，将最佳切割温度包埋剂倒入包埋模具中，并将股骨放置于包埋模具底部。在液氮中快速冷冻样本。

待样品完全冻结后，用铝箔包裹，并在干冰中转移至超低温冰箱。在进一步处理前，于零下80摄氏度保存。首先，将冷冻切片机的温度设置为零下19摄氏度，样品夹持块的温度设置为零下17摄氏度。

接下来，用70%乙醇擦拭冷冻切片机内部。将硬组织用的一次性刀片、载玻片和适配工具放入冷冻切片机中预冷，并在整个切片过程中保持其在机内。将置于干冰上的冷冻组织块转移至冷冻切片机中，使其平衡至少10分钟。

然后，按压包埋模具的底部，将OCT包埋块推出模具。在样品托上涂抹适量OCT包埋介质，使包埋块粘附于其上，并等待OCT介质完全冻结。随后，将样品托放入物镜架中并固定紧实。

调整刀片位置，以15微米的切削增量修整包埋块，去除覆盖样本的OCT。调节恒冷切片机以产生8微米的切片，切下2至3张将被弃去的冷冻切片。将粘附膜贴附于包埋块上，并使用配套工具将膜牢固粘附在包埋块表面。

现在，在用膜固定组织条带的同时，缓慢且以恒定速度进行切片。将样本朝上的膜置于冷冻恒温箱内冷台上预冷的载玻片上，以防止样本解冻。使用胶带将膜固定在载玻片上，以便后续染色操作。

在通风橱中，按照文本方案所述，将乙醇、无RNase水和二甲苯溶液置于冰上配制备用。将切片在95%乙醇中孵育30秒。然后，小心地将切片浸入无RNase水中30秒，以彻底去除OCT包埋剂。

接下来，将50微升商用LCM冷冻切片染色剂滴加到切片上，在室温下孵育10秒。将玻片边缘置于吸水纸上，使切片沥干。用100%乙醇冲洗切片30秒，以去除多余的染色剂。

将骨组织切片浸入另一管含有100%乙醇的容器中，持续30秒，随后转移至100%二甲苯中30秒。在干燥的玻璃载片上贴附一层粘附膜作为支撑，注意尽量将膜铺平。随后，将一张PET膜框架载片置于膜上，并用戴手套的手指轻轻按压膜表面，使其牢固粘附于膜上。

该样品将被夹在膜和粘性膜之间。粘性膜不应折叠或起皱，且膜与粘性膜之间不应有气泡。首先使用表面去污剂清洁样品台端盖支架。

将载玻片放入载玻片架中，将盖玻片放入盖玻片架中。接着，调节焦距，使用1.25倍物镜获取载玻片的概览图像。然后切换至40倍物镜，并调节焦距。

使用切片概览选择感兴趣的区域。然后按照此处所示调整激光参数，并确保针对每个物镜优化这些参数。如果激光无法切割样本，请增加激光功率。

根据形态学标准，选择股骨远端松质骨或皮质骨中的成骨细胞、骨细胞和骨衬细胞。将激光路径线画在距离目标细胞较远的位置，以尽量减少紫外激光造成的损伤。如果激光未能切断样本，可多次施加激光，或检查目标区域是否存在切割不完全的位点，并使用移动和切割功能对这些区域进行补切。

将每种细胞类型分别收集到一个 0.5 毫升的离心管盖中。首先，向收集管的管盖内加入含β-巯基乙醇的裂解缓冲液 50 微升。通过在管盖中上下吹打样品一分钟，使样品裂解。

接下来，离心沉淀裂解液，并向管中加入 00 微升含有β-巯基乙醇的裂解缓冲液。每张切片准备一个标记好的微量离心管，内含 350 微升含有β-巯基乙醇的裂解缓冲液。利用激光显微切割（LCM）后剩余的组织切片提取 RNA。

小心地将薄膜从膜上分离，并通过多次缓慢地将裂解缓冲液吹打至切片上以裂解样品。然后将裂解后的样品置于干冰上，并在零下80摄氏度保存。当准备继续实验时，在室温下解冻裂解物。

此后，将收集管中经激光显微切割（LCM）获取的细胞裂解液转移至新的1.5毫升微量离心管中，并根据试剂盒说明书提取RNA。本研究建立了一种LCM实验方案，用于从小鼠股骨骨细胞中获得足量且高质量的RNA，以进行基因表达分析。LCM操作使用基于重力原理进行样本收集的激光显微切割系统完成。

使用微毛细管电泳法测定分离RNA的得率和完整性。通过不同裂解方案获得的RNA质量和数量差异可在此处的代表性凝胶图和电泳图谱中观察到。当样品在毛细管中通过上下吹打裂解一分钟时，可从一平方毫米显微切割的骨组织中分离出约8.5纳克的RNA。

RIN 值为 8.60。或者，可使用激光捕获显微切割系统进行 LCM，该系统采用散焦激光脉冲，将材料弹射至悬垂的粘附帽中。对于新鲜冷冻骨组织，可从一平方毫米显微切割的骨组织中分离出约 1.6 纳克的 RNA。

RIN 值为 1。总之，本操作中需要牢记的最重要事项包括：正确应用标准方案，防止夹心复合物中的切片完全干燥，使用合适的激光显微切割系统，以及不要超过细胞采集的时间限制。在从捕获的细胞中分离出 RNA 后，即可利用该 RNA 进行表达谱分析，例如通过 RNA 测序。

最后，我们提醒您，二甲苯和β-巯基乙醇是危险物质，必须在通风橱中操作。此外，处理液氮以及冷冻切片机刀片时，请采取适当的防护措施。