一种基于延时、无标记、定量相位成像的休眠与活跃人癌细胞研究

本实验的总体目标是通过系统性地结合细胞形态、增殖和运动能力分析，对人骨肉瘤细胞的促血管生成表型和非促血管生成表型进行定量表征。该方法有助于解答有关人类癌症发生与进展的关键科学问题，特别是肿瘤休眠逃逸及内源性转换机制。

该技术的主要优势在于，可通过这种集成式高通量方法同时分析多种多细胞参数，包括细胞面积、细胞厚度、细胞体积、增殖率、倍增时间、运动速度、迁移能力及运动性。实验开始时，将培养基置于水浴中预热至 37 摄氏度。

然后从液氮罐中取出血管生成型和非血管生成型人骨肉瘤细胞的冻存管。将冻存管底部浸入37摄氏度水浴中，并轻轻摇动冻存管以加速解冻过程。细胞一旦解冻，立即用70%乙醇喷洒冻存管并擦拭管壁以进行消毒。

然后立即从小瓶中吸出细胞悬液，并用10毫升预热的培养基轻轻重悬细胞。接着将细胞悬液以离心力离心5分钟，使细胞沉淀。回到生物安全柜中，吸除上清液，并用10毫升预热的培养基重新悬浮细胞沉淀。

然后将细胞悬液转移至T75培养瓶中。轻轻吹打细胞悬液数次，以均匀分散细胞。将培养瓶放入培养箱中，使细胞贴壁至少12小时。

每两到三天更换一次培养基。当细胞融合度达到 80% 至 100% 时，从培养瓶中移除培养基，并用五毫升不含钙和镁的无菌 PBS 洗涤细胞。然后向培养瓶中加入一毫升 0.25% trypsin-EDTA 溶液，轻轻旋转培养瓶使其混匀。

将培养瓶孵育两到三分钟，然后在显微镜下观察细胞，确保细胞已变圆并脱落。待细胞完全脱落后，用移液器加入10毫升培养基，并轻轻吹打数次，以分散任何残留的细胞团块。细胞计数后，将两百万个细胞接种至新的T75培养瓶中。

将培养瓶放入培养箱中，使细胞生长至80%到100%融合度，然后进行定量相位成像实验的接种。通过胰蛋白酶消化收获细胞，并将促血管生成型和非促血管生成型人骨肉瘤细胞以每孔50,000至300,000个细胞的密度接种于6孔板中。每孔加入总共5毫升培养基覆盖细胞。

然后将培养板孵育至少12小时，以使细胞有足够时间贴壁。成像前更换为新鲜培养基。用流动的去离子水反复冲洗盖玻片数次以清洁。

然后将其浸入75%乙醇溶液中15分钟。将灭菌后的盖玻片放入超净工作台中晾干。接着小心地将盖玻片放入六孔板中，避免产生明显气泡。

将培养板放入培养箱中，平衡至少15分钟。如果培养板盖上形成雾气，请使用无菌棉签在成像前将其擦拭干净。打开定量相位成像软件并初始化系统。

确保曝光时间、图案对比度和全息噪声的自校准数值在可接受范围内。接下来，将六孔板放置在定量相位成像显微镜的载物台上。返回软件界面，点击实时采集。

然后进入软件对焦菜单并选择手动模式。接下来进入显微镜设置菜单，通过调整工作距离来粗略对焦细胞的相差图像，以获得相差图像中细胞的轮廓。完成后，返回软件对焦菜单并将对焦模式更改为自动。

现在点击“新建实验”。使用鼠标或数字小键盘上的箭头键选择图像采集位置。每次选择后点击“记住”。

所有位置选定后，进入延时成像部分，设置成像时间间隔，使其短于5分钟，总时长为48小时。点击“capture”开始实验，系统将自动对焦，并在每个时间点对选定位置进行图像采集。

完成图像采集后，首先点击“识别细胞”来分析细胞形态。调整背景阈值的数值设置，使细胞区域与背景噪声充分分离。接着调整物体大小的数值设置，确保每个细胞仅包含一个细胞核。

使用手动修改功能，对不符合此要求的任何细胞区域进行人工调整。然后使用软件中的“分析数据”功能来分析细胞。通过点击“新建分析”来开始新的数据分析。

将选定的图像拖入源帧标签页，记录每个单个细胞的细胞形态参数，包括细胞面积、光学厚度和体积。完成后，选择散点图或直方图模式，并将数据导出为表格或图像。选择至少五张间隔12小时的图像，并记录软件提供的细胞数量。

通过将细胞数量与初始细胞数进行归一化，估算细胞的增殖速率，然后绘制细胞数量曲线。最后，通过使用指数生长曲线拟合数据点来估算倍增时间。为分析细胞运动，使用软件中的“追踪细胞”功能。

首先点击“新建分析”以开始新的数据分析。然后，将感兴趣时间段内的一系列图像拖动到“源帧”标签页中。接下来，在“添加细胞”选择模式下，通过单击随机选择10至30个细胞。

务必仔细检查图像序列中的追踪情况。如果系统丢失了某个细胞的追踪或追踪到了错误的细胞，可通过点击“识别”来识别细胞，或进入选择模式后点击“修改位置”来手动调整该细胞的追踪位置。完成后，进入“绘制运动”界面，选择“细胞轨迹的行图”，或进入“绘制特征”界面绘制其他与运动相关的参数，如运动速度、运动性、迁移和迁移方向性。

将数据导出为表格或图像。在本方案中，定量相位图像以全息图形式呈现。此处显示的细胞代表了血管生成性与非血管生成性人骨肉瘤细胞的典型细胞形态。

细胞厚度通过折射率和光程长度计算得出，此处以散点图显示。两种不同细胞表型呈现出不同的分布模式，表明血管生成性细胞的细胞面积较小，而细胞厚度大于非血管生成性细胞。这两种细胞类型的细胞增殖率可通过此类二维图像进行计算，这些图像已进行分割，并覆盖两天的时间过程。

对于这些特定的细胞类型，未发现显著差异。为了确定细胞的运动特征，必须随时间推移对单个细胞进行选择和追踪。此处用不同颜色标出了被追踪的细胞。

每个单个细胞在四小时内被持续追踪，其总运动轨迹如图所示，其中（0,0）点为细胞的起始位置，终点位置由彩色圆点标示。观看本视频后，您应能够充分理解如何利用定量相位成像技术，对细胞形态学和行为学参数进行定量比较，本例中即为血管生成性与非血管生成性细胞表型之间的比较。

在此发展之后，该技术为癌症研究领域的研究人员探索肿瘤休眠逃逸及其过程中血管生成的作用铺平了道路。该技术基于一个连续且无需标记的平台。请注意，操作人类细胞系可能具有极高危险性，在进行该操作时，必须采取佩戴个人防护装备等预防措施。