透过表象：利用延时显微镜与单细胞纵向追踪研究抗癌治疗药物

本实验的总体目标是在培养条件下观察单个细胞对抗癌治疗的反应。该方法可解答癌症研究领域中的一些关键问题，包括治疗反应的异质性以及细胞命运的决定。首先，在经过认证的无菌超净工作台内，根据文本方案将HT1080细胞接种于经培养认证的培养皿中，并将细胞置于湿润的细胞培养孵育箱中进行孵育。

成像前两天，将50,000个HT1080 FuGENE细胞接种至12孔、1.5号玻璃底培养皿的每个孔中，孔数根据实验需求确定。根据细胞的生长速率和所用培养皿的类型调整接种细胞数量，使实验开始时细胞汇合度约为60%。

将环境培养室的湿度设置为约80%，样品位置的温度设置为37摄氏度。按照制造商的说明，确保水箱中已装入无菌蒸馏水。然后将环境培养室开启至所需温度设定，并将其放置在显微镜载物台上并进行设置。

如果载物台顶部腔室与载物台嵌入部分之间存在任何空隙，请在将腔室插入之前，先在载物台嵌入开口的边缘覆盖几片石蜡膜，以实现腔室与载物台的耦合。确保没有任何连接线对腔室产生牵拉，这些因素均可能引入运动伪影。将装有水的假培养皿插入腔室内，使腔室温度平衡至37摄氏度，随后维持温度稳定。

进行成像前的准备工作时，打开显微镜、计算机及所有必要的外设。根据光源类型，可等待至需要时再开启光源。将物镜转换器调至低位，选择20倍、数值孔径为0.7的物镜。

然后将样品置于物镜上方，这样在样品放入培养腔后更容易找到细胞。根据文本方案，将待成像的细胞转移至环境培养腔后，密封培养腔以维持稳定的环境，并开启气体环境。接下来，选择成像条件，通过限制曝光时间并使用较低强度的光照，以避免光毒性。

确定每个成像位置的X、Y和Z平面以及所需的波长。对于大多数细胞过程的长期延时成像，每十到二十分钟采集一次图像。更高的时间分辨率可提供更多的数据点和更可靠的细胞追踪，但会导致更高的累积光暴露以及更大的数据集。

由于 HT1080 FuGENE 含有动态的绿色和红色荧光蛋白，请使用以下曝光时间，并采用 2×2 binning 模式。在高级设置中，启用软件控制的自动对焦功能，并使用默认参数。将自动对焦范围设为 10 微米，并采用推荐的步长尺寸。

在实验培养皿中，为减少热漂移，将一半培养基更换为已预热至 37 摄氏度并含有目标药物的培养基。最后，启动延时成像，并按照文本方案采集图像。这些视频展示了成对匹配的乳腺癌来源 MCF7 细胞系的示例，这些细胞系仅在 p53 状态上有所不同，且经一种抑制驱动蛋白-5 的抗癌药物处理，导致有丝分裂停滞。

如图所示，当通过稳定的p53敲低去除p53后，细胞在退出有丝分裂后不再发生细胞周期阻滞，而是进入重复的周期，再次进入有丝分裂而非发生阻滞，并在未分裂的情况下退出有丝分裂。图中显示的是来源于宫颈癌的HeLa细胞，这些细胞稳定表达与mCherry融合的染色质标记物组蛋白2b以及与EGFP融合的β-微管蛋白。当用微管稳定药物紫杉醇处理时，有丝分裂过程中染色体的排列和分离受到破坏，导致核膨出和微核的形成，而这些结构容易发生DNA损伤。

该细胞系稳定共表达两种荧光泛素细胞周期指示剂，其中 CDT1 为橙色，geminin 为绿色，细胞能够正常进行细胞周期。当对相同细胞使用 CDK4/6 抑制剂处理时，细胞可正常通过 G2 期并完成分裂，随后在 G1 期发生强烈阻滞，表明该方法在生长中的肿瘤中具有产生有效细胞静止效应的潜力。该技术的主要优势在于，可直接、实时地连续数天追踪单个细胞的反应，而非通过间接推断获得结果。