全面评估的综合流程 体外 使用球体出芽实验评估假定性血管母细胞瘤新生血管形成能力

本实验的总体目标是利用体外球体出芽实验评估假定的血管母细胞瘤新生血管形成能力。该方法有助于回答血管生成领域中的关键问题，例如肿瘤血管生成。该技术的主要优势在于，它提供了一种全面的体外评估流程，可用于研究经典的肿瘤血管生成在血管母细胞瘤中是否存在及其在血管母细胞瘤中的生长情况。

该技术的应用意义延伸至血管母细胞瘤和脉管系统的治疗，因为实验结果凸显了血管母细胞瘤新生血管形成的复杂性，表明这种常见的血管生成形式仅是一种辅助机制。因此，该方法可为血管母细胞瘤新生血管形成的研究提供深入见解。此外，该方法还可应用于某些实体瘤中与肿瘤、血管生成及血管发生相关的研究，例如玻璃体肿瘤中的肿瘤血管拟态。

该方法的真实演示至关重要，因为这些经操作的内皮细胞球体的制备步骤难以掌握。合适的条件尤为关键。首先，在添加了10%胎牛血清、青霉素和链霉素的DMEM培养基中培养HUVEC内皮细胞。

然后，将培养物置于37摄氏度、含5%二氧化碳的培养箱中继续培养。接下来，为合成shRNA片段，使用ApaI和EcoRI限制性内切酶对质粒进行酶切。随后，在酶切后的质粒中加入正向和反向寡核苷酸引物、10x NEB缓冲液以及重蒸水，总体积为50微升。

加入所有试剂后，将混合物在98摄氏度加热四分钟。随后，在数小时内逐渐冷却至室温。使用T4连接酶连接退火后的寡核苷酸与质粒。

将试管在4°C下孵育过夜。次日，向25微升DH5alpha感受态细胞中加入5微升连接反应混合物。在500微升DMEM培养基中，加入慢病毒载体或乱序对照载体，以及其他包装质粒。

然后，将慢病毒混合液在37摄氏度孵育25分钟。孵育结束后，向对照或慢病毒混合溶液中加入7毫升DMEM培养基。将293FT细胞在不含胎牛血清的DMEM培养基中，于10厘米培养皿中进行培养。

向培养皿中的293FT细胞加入一毫升慢病毒或乱序对照溶液。六小时后，吸除培养皿中的旧培养基，然后更换为含有10%胎牛血清的新鲜DMEM培养基。

48小时后，收集培养基。将HUVEC内皮细胞转入含慢病毒的培养基中，继续培养72小时。随后，在HUVEC细胞培养基中加入浓度为2微克/毫升的嘌呤霉素。

最后，将培养物再孵育24小时。次日，加入1毫升胰蛋白酶EDTA溶液以消化HUVEC细胞。然后将消化后的细胞悬液重悬于含10%胎牛血清的DMEM培养基中。

使用细胞计数器对细胞数量进行计数。计数后，将细胞接种至3D圆底96孔板中。接种后，将细胞在37摄氏度、5%二氧化碳条件下持续培养72小时。

36 小时后，用新鲜培养基更换一半的培养液。首先，在 4 摄氏度下解冻凝胶溶液，然后用低血清培养基按 1 比 5 的比例稀释。使用微量移液器从 DMEM 培养基中吸取球状体。

接下来，用五毫升低血清培养基洗涤类球体。小心地转移悬浮的类球体和稀释后的凝胶。在15孔板中，加入300微升类球体与稀释凝胶的混合液进行包埋。

将培养板置于37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育1小时。随后，向单个孔中加入400 µL低血清培养基。为防止蒸发，用无菌水填充该孔周围的区域。

随后，将细胞在37摄氏度、5%二氧化碳、100%湿度条件下培养1小时。孵育结束后，吸除旧培养基，向孔中加入600 µL含1%内皮细胞生长补充剂的低血清培养基，继续孵育1天。使用倒置光学显微镜采集图像。

此处利用倒置光学显微镜观察细胞的球状体出芽现象，以研究VHL基因沉默对内皮细胞血管生成潜能的影响。在慢病毒处理后12小时，对照组和VHL基因沉默的内皮细胞球状体均可见出芽。接下来，通过统计学分析定量评估VHL基因沉默球状体所产生的出芽长度。

VHL 沉默组的平均出芽长度约为 125 微米，而对照组仅为约 65 微米。VHL 沉默组的平均累计出芽长度约为 1250 微米，而对照组为 680 微米。这些结果表明，VHL 沉默组的出芽长度增加了约两倍。

一旦掌握，该技术若操作得当，可在48小时内完成。通过遵循本实验步骤和方法，还可开展诸如毛细血管形成实验等进一步研究，例如探究血管内皮细胞的血管生成能力。

随着这一进展，该技术为血管生成领域的研究人员探索肿瘤内部血管化提供了途径。观看本视频后，您应能充分了解在用于爆裂实验的经操纵内皮细胞中哪些基因丧失了功能。