体外 利用小鼠胚胎干细胞进行血管生成的三维出芽实验，用于血管疾病建模与药物筛选

本方案描述了一种体外出芽型血管生成检测方法，可模拟血管形成的多种特征，并可用于药物测试。该方法易于在实验室中实施，具有良好的稳健性和可扩展性。其与使用人内皮细胞和微球的检测方法具有诸多相似之处。

该模型能够稳健地模拟表型，表现出内皮顶端细胞选择缺陷和定向内皮细胞迁移异常，从而导致病理性血管生成。本研究可为调控出芽式血管生成的机制、关键基因及信号通路提供见解，尤其是通过开展遗传筛选实现。主要挑战在于维持小鼠胚胎干细胞在培养过程中的质量或 pluripotency（多能性）。定期检测细胞系的多能性状态及其形态学特征至关重要。

对细胞系进行核型分析也非常重要，因为它们在培养过程中容易丢失或获得染色体。首先，向六孔细胞培养板中的一个孔加入500微升0.1%明胶溶液，进行包被，并将其置于二氧化碳培养箱中孵育30分钟。随后用PBS洗涤明胶包被的培养板，并加入500微升新配制的CM±培养基。

为了获得纯的小鼠胚胎干细胞（mESCs）群体，使用10倍体积的TVP缓冲液在室温下消化细胞培养板30秒。随后将细胞重悬于1毫升中胚层分化培养基中，然后转移至经明胶包被的6孔板中孵育30分钟，使小鼠胚胎成纤维细胞贴壁，而mESCs保持悬浮状态。将细胞悬液转移至15毫升离心管中，用台盼蓝染色后在Neubauer血细胞计数板上计数活细胞。

然后在室温下以200 × g离心细胞5分钟。弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于适量的中胚层分化培养基中。通过向底部加入15毫升无菌水，准备四个94毫米低吸附性聚苯乙烯培养皿。

将细胞悬液转移至无菌塑料储液槽后，用多通道移液器的四个通道分别吸取22微升细胞悬液。将94毫米培养皿的倒置皿盖内面朝上放置于超净台的洁净表面上。将细胞悬液在每个皿盖内表面滴加40滴，然后小心地将皿盖翻转，避免扰动，重新放回培养皿上，使液滴朝向水面。

将培养皿置于二氧化碳培养箱中孵育四天，以此作为分化第零天。孵育四天后，使用P1000移液器将悬滴收集至15毫升锥形管中。让EB在管中沉降，然后移除上清液。

将EBs重悬于3毫升2倍血管分化培养基中，然后转移至60毫米琼脂包被的培养皿中，并均匀分布EB悬液。将培养皿置于二氧化碳培养箱中培养至第9天，每两天更换一次培养基。通过在35毫米培养皿底部加入1毫升出芽培养基，制备培养皿。

为诱导凝胶化，将培养皿在37摄氏度下孵育5分钟。从一个琼脂培养皿中收集9天龄的拟胚体至15毫升锥形管中，并移除上清液。用2毫升冷的出芽培养基重悬拟胚体，转移至已包被第一层出芽培养基的培养皿中。

将拟胚体均匀分布在培养板上，确保彼此间距相等。在培养约24至48小时后，应可见首个芽状结构形成。在第12天，使用刮铲小心地将含有拟胚体的胶原凝胶转移至载玻片上。

用移液器吸除多余液体，并在凝胶上方放置尼龙纱布和吸水滤纸以脱水。用250克重物加压两分钟。然后移除尼龙纸，使载玻片在室温下晾干30分钟。

干燥后，于4°C条件下用锌溶液固定EBs过夜。次日，在用PBS洗涤载玻片五次之前，先去除固定液。使用含0.1% Triton X-100的PBS对EBs进行透化处理。

孵育15分钟后，除去透化溶液，用PBS洗涤载玻片，每次5分钟，共洗涤5次。将拟胚体在封闭缓冲液中室温孵育1小时，随后用PBS洗涤5分钟。然后加入用封闭缓冲液稀释的一抗，于4摄氏度孵育过夜。

然后将切片置于封闭缓冲液中，与山羊抗大鼠Alexa 555二抗在室温下孵育两小时。孵育结束后，用PBS洗涤切片三次，每次五分钟，再用水洗涤一次，随后封片进行显微镜观察。三维出芽型血管生成实验在三个胚胎体（EBs）上进行，使用了两种药物DC101和DAPT。

随着浓度增加，这两种化合物在EB模型中逐渐抑制了血管生成。EB中不同浓度的药物显示，高剂量的DC101会抑制血管芽的数量和长度。而DAPT在1 µmol/L剂量下则表现出相反的作用。

DAPT 在低剂量下即可显著增加每条血管出芽中具有导向缺陷表型的内皮顶端细胞数量，而 DC101 无此效应。在来源于 ACVRL1 野生型和 ACVRL1 杂合基因型的遗传性出血性毛细血管扩张症类胚体中，观察到血管出芽异常，大量出芽以相对于母体血管的随机角度出现导向缺陷表型。将一种野生型小鼠胚胎干细胞系与另一种未标记的野生型小鼠胚胎干细胞系以 1:1 比例混合，结果两者对前端内皮顶端细胞的贡献均等。

对该代表性嵌合体EB进行显微分析，以确定前沿内皮尖端细胞的基因型来源。为了定量分析血管芽的壁细胞覆盖情况，将EB固定并用内皮细胞标志物PECAM和壁细胞标志物α平滑肌肌动蛋白进行染色。高倍镜图像显示，单个血管芽被壁细胞所包围。

在进行颜色通道分离后执行二值化转换，并对由α-SMA阳性壁细胞包覆的PECAM阳性血管所占比例进行定量分析。胚胎干细胞系的遗传背景也是研究人员必须考虑的关键因素，因为不同细胞系的出芽能力存在差异。该方法可用于利用RNA干扰技术或携带基因突变的小鼠胚胎干细胞库进行遗传筛选。