利用高压冷冻电镜断层扫描技术观察蓝细菌中的DNA压缩现象

该方法有助于解答微生物学领域中的一些关键问题，例如细菌细胞周期过程中DNA结构如何变化。该技术的主要优势在于，无需任何额外处理，即可在适当的时间点观察接近活体状态的完整细菌细胞的超微结构。本次实验操作将由我实验室的博士后研究员 Chihong Song 和 Kaneko 博士实验室的研究生 Mako Hayashi 进行示范。

首先在含有1.5%琼脂和0.3%硫代硫酸钠的9厘米无菌BG-11平板上培养蓝细菌。将平板置于23°C、光照强度为每平方米每秒50微爱因斯坦（µE）、光暗周期为12小时光照/12小时黑暗的条件下培养。为维持细胞生长，需每周将其转接至新鲜的BG-11琼脂平板上。

一周内，培养物会呈现为绿色条带。使用经火焰灭菌的接种环转移绿色的细胞团块，并在新培养板上划线接种。为观察DNA压缩情况，于光照周期结束时收集培养六天的细胞。

为使细胞从培养板上脱落，加入一毫升 0.2 摩尔的蔗糖溶液。随后收集细胞悬液，并重复添加和去除蔗糖溶液，直至溶液变为绿色。溶液颜色变化表明大部分细胞已被释放。

现在，将500微升悬浮细胞溶液转移至微量离心管中，加入Hoechst染料，使其终浓度为每毫升1微克。然后，将细胞在避光条件下孵育10分钟。接着，离心收集细胞，弃去上清液，并将细胞重悬于10微升0.2摩尔的蔗糖溶液中。

接下来，取一微升悬液转移至载玻片上，加盖盖玻片，并在配备紫外滤光片的荧光显微镜下观察细胞。使用100倍油镜观察，寻找DNA压缩的证据，该现象应在大多数细胞中可见。首先，准备浸入式冷冻装置。

然后，通过插入乙烷容器和冷却棒附件来设置液氮容器。接着，向容器中加入液氮，并将其冷却至液氮温度。之后，将乙烷气体充入容器中。

务必佩戴护目镜，因为液态乙烷具有爆炸性。最后，取下冷却棒附件，并用塑料盖盖住容器，以防止结霜。接下来，使用等离子离子屏障对碳涂层电镜载网的碳面进行辉光放电处理，电流为50毫安，持续30秒。

然后，根据测试方案准备Vitrobot。使用镊子将预处理的电镜载网放入样品室。在加样前，先用一微升、15纳米的BSA金标记物处理电镜载网，作为定位标记。

现在，取 2.5 µL 细胞悬液滴加到载网上。用滤纸吸去多余的溶液，并立即在液态乙烷中冷冻载网。将冷冻后的载网保存在液氮中，直至进行观察。

接下来，启动高压电子显微镜（HVEM），并将其设置为1兆伏的高电压。然后，使用液氮将样品载网支架冷却至零下150摄氏度。冷却后，将冷冻的载网装入已冷却的低温样品支架中，并将其载入HVEM。

注意避免冰污染装置。现在，以1,000倍的低倍率选择成像区域。然后，调节同心z轴高度，并将样品台倾斜至负60度。

然后，消除倾斜旋转的回程间隙。现在，以10,000倍的放大倍数在目标位置附近进行聚焦。通过偏离聚焦图像，设置六到十微米的欠焦量。

进行成像时，将电子剂量设置为每平方埃每秒两个电子或更低。注意观察反映电流密度的电子剂量，并通过数码相机或电子胶片采集图像。接着，以负60度到正60度的倾斜范围，每隔2至4度收集一次倾斜图像。

如果可能，请使用显微镜的自动化功能。打开商业软件包，并加载用于断层重建的倾斜图像。然后，使用命令 tif2mrc 或 newstack 从单个图像创建图像堆栈文件。

接下来，启动 eTomo 图形用户界面软件，输入图像参数，包括像素尺寸、标志点直径、图像旋转等，从而创建编辑脚本。现在，使用推荐的软件生成倾斜系列图像，并利用标志点进行对齐，使平均残差误差小于 0.5。

最后，使用 SIRT 算法重建三维断层图像。然后从断层图像中提取感兴趣区域，并应用去噪滤波器，例如各向异性扩散滤波器、双边滤波器或数学形态学滤波器。采用能够增强图像对比度的参数进行滤波处理。

接下来，分割感兴趣的特征。使用切片功能打开断层图像，然后进入“分割编辑器”窗口，选择一个新的标签域以创建分割文件。

然后，在第一层图像中手动描画出目标特征的边界，接着依次描画其他各层图像中的相应边界。可使用相同的操作添加其他感兴趣的目标特征。现在，为了利用 SurfaceGen 菜单中的选项生成表面渲染图像以可视化已分割的体积，选择 SurfaceView 菜单。

要移动、旋转和缩放三维图像，请使用三维查看器窗口中的工具。可使用魔棒工具进行自动分割。单击某个对象，然后调节显示和掩膜中的滑块，以确保该对象的特征被完全选中。

在精确的同步培养条件下，用Hoechst标记的DNA在黑暗环境中呈现正常的均匀分布，随后在光照期间逐渐在细胞内凝聚，到光照期结束时形成波浪状的杆状结构。最终，该杆状结构在中央分裂，其两部分被分配到子细胞中。细胞分裂后，凝聚的DNA立即消失，DNA恢复为正常的均匀分布状态。

当处于DNA压缩最后阶段的细胞被冷冻并使用高压电子显微镜观察时，许多细胞显示出明显的DNA压缩结构，可轻易与正常细胞区分开来。一些细胞在细胞中央出现收缩，符合细胞分裂前的预期特征。从三维断层图像中可见，致密的DNA在细胞质中明显分离，并被低密度物质所包围。

类囊体膜层沿着致密DNA的波浪状棒状结构发生扭曲。有趣的是，许多小型磷酸盐体附着在致密的DNA上，通常成对出现。这些多聚磷酸盐体可能是DNA合成所需磷酸盐的供应来源。

观看本视频后，您应能够充分理解如何通过冷冻高压电子显微镜技术，在无需染色等额外处理的情况下，于适当的时间点对处于接近活体状态的完整细菌细胞超微结构进行可视化观察。在进行该实验操作时，需特别注意：在光照周期结束后的每一分钟，DNA 的压缩状态都会发生变化，因此务必确保不错过最佳的样品冷冻时机。

在完成此操作后，可进一步采用其他方法（如CLEM），以探究特定蛋白质或核苷酸在压缩DNA中的定位问题。该技术建立后，将为微生物学领域的研究人员探索细菌或小型真核生物中的细胞分裂、DNA分离以及病毒感染等过程提供重要途径。