通过电子冷冻断层扫描技术可视化线粒体中的ATP合酶二聚体

本实验的总体目标是确定 C two 中线粒体蛋白质的结构与组织形式。首先制备含有样品的冷冻水合电子显微镜载网，随后在冷冻电子显微镜中对样品进行剂量受限的倾斜系列图像采集。

然后对倾转系列进行处理，以生成断层成像体积。最后，对蛋白质密度进行平均，以确定蛋白质的结构，并对膜进行分割以揭示其三维结构。通过将蛋白质的平均结构重新定位回断层图像中，可揭示膜中蛋白质的结构与空间排布。

因此，我们对线粒体进行电子冷冻断层扫描，以期在分子水平上理解其工作机制。与薄塑料切片的电子显微镜技术相比，该方法的主要优势在于分辨率更高。样品无需任何化学固定，蛋白质的分子细节得以完整保留。

电子冷冻断层成像技术需要一定时间才能掌握，但经验丰富的使用者每次实验可获得五到六个高质量的断层图像。该实验流程中最困难的部分是制备冰层厚度适宜的冷冻水合网格。根据文本方案，在分离并离心收集线粒体后，使用含有10毫摩尔每升HEPES缓冲液的250毫摩尔每升三羟甲基氨基甲烷（Tris）溶液重悬沉淀物，使总蛋白浓度约为每毫升5毫克。按照制造商说明，将全碳支持膜电子显微镜网格（碳膜面朝上）置于真空装置中进行辉光放电处理。将少量乙烷气体通入经液氮冷却的铝制容器内壁，使数毫升乙烷液化。

使用一对镊子夹取一个经过辉光放电处理的DM载网，将其放置在实验台上。将蛋白溶液与标记金 fiducial 悬液按1:1比例混合，再与线粒体悬液混合，立即取三微升混合液滴加到载网上。接着，将镊子放入冷冻固定装置（如自制的 Guillotine 装置）中，用滤纸楔形部分从载网上吸去多余液体，然后释放触发装置，迅速将载网浸入液态乙烷中。随后，将载网从液态乙烷转移至液氮中。

通过将一张新的滤纸楔形尖端插入液态乙烷中，去除载网上多余的乙烷。当液体沿滤纸上行时，轻柔地将载网沿滤纸向上拖动，始终保持载网位于液面前端以下，随后立即将其转移至液氮中保存以备后续使用。将载网放入载网盒中，并置于充满液氮的杜瓦瓶内，用于记录断层扫描倾斜系列图像。

首先确保液氮罐已加满，并检查样品台和载网转移装置的温度低于100开尔文。通过拍摄测试载网的图像并检查晕圈的质量来确认透射电子显微镜已良好校准：晕圈应呈圆形并延伸至图像边缘。接着，插入载有冷冻水合线粒体的载网。

然后进入搜索模式，寻找冰层厚度和样品质量合适的区域。对有希望的区域拍摄六秒的搜索图像，以确定其是否适合进行数据采集。找到合适的样品区域后，将载物台向正负60度方向倾斜，以确定在不被支撑栅栏或附近外观相似的冰孔中冰晶遮挡曝光或聚焦区域的情况下可达到的最大倾斜范围，随后切换至曝光模式，并调整电子束强度或图像采集时间。

因此，每幅记录的图像对于CCD而言，其电子剂量为每像素30至50个电子，或每像素每秒6至8个电子。对于直接电子探测器，通过将零度下采集的一秒图像在无孔区域的平均电子计数除以60度下同样区域的一秒图像的电子计数，计算剂量分布比率（即I₀/I₆₀）。在曝光模式下采集一幅一秒图像，并记录每平方埃的电子计数。

根据剂量分布比例，使用合适的自动数据采集软件，计算在特定总电子剂量下可记录的图像总数和倾斜间隔。按照刚刚确定的典型断层参数，设置并记录断层图。对于这些样品，从正负20度开始，在达到高倾斜角度之前经过零度。

为创建和分割断层图像，需先将倾转系列数据转换为适用于重建软件的文件格式。使用 Tom Graham 重建程序（如 Im mod），通过标记金标示踪物的位置对图像进行对齐。对齐后，生成 Tommo Graham。

通过使用图像滤波器（例如与 IM o 一起发布的非线性各向异性扩散滤波器）来增强 tommo Graham 的对比度，以用于可视化。使用商业软件对 Tom 进行手动分割。将对应于内膜和外膜的体素分配到不同的层，分配完成后，生成表面以可视化膜结构。

使用 emira 的 EM 软件包插件中的点击工具，以已标记的颗粒作为输入，并结合适当软件包（如颗粒估算软件），标记 TP 合成酶颗粒的位置。对于电子断层扫描程序，计算一幅平均图像以进行分辨率估算。使用免费可视化程序，计算两个独立确定的子断层平均图像之间的首层壳层相关性。

Chimera 软件首先通过手动方式，然后使用本图所示命令自动拟合，将已知的X射线结构放入亚层析平均图Agram中。对线粒体电子冷冻显微镜图像中的膜进行手动分割，可揭示线粒体中嵴的结构。通过成像缺乏特定蛋白质的酵母敲除菌株的线粒体，可以评估这些蛋白质对嵴形态的影响。

图中所示为缺乏 TP 合酶亚基 E 的酵母菌株的线粒体，该亚基是形成 ATP 合酶二聚体所必需的。与野生型线粒体正常的嵴结构不同，这些细胞器包含许多内膜结构，这些结构要么缺乏嵴，要么含有小型球状的膜内陷结构。在对比度良好的图像中，ATP 合酶二聚体清晰可见，如图中黄色箭头所示。

通过分割膜结构，可以可视化三磷酸腺苷（ATP）合成的位置（以黄色球体表示）与嵴形态之间的关系。在此情况下，ATP合成以二聚体形式排列成行，沿低曲率嵴亚区高度弯曲的边缘分布。亚断层平均技术使得蛋白质结构的分辨率可达四纳米或更高。通过将已知的X射线结构拟合到亚断层平均图中，可以组装出蛋白质复合物在其天然环境中的原子模型，如图所示。

在此示例中，平均体积可重新放入Tomo Graham中，以帮助确定各个复合物之间以及它们与膜中其他蛋白质复合物的相对空间排列。本方案展示了如何利用电子冷冻断层扫描技术来解析线粒体内膜中蛋白质复合物的结构与组织方式。该方案也可用于确定不同细胞区室中其他膜结合蛋白的结构与组织形式。

样品制备是获得良好热图谱的关键。冷冻水合载网必须含有厚度为70至150纳米的完全玻璃态冰层。通常需要筛选五到六个载网，直至找到冰层厚度和样品质量均处于最佳状态的区域。

对于断层扫描数据的采集，最好使用配备专用冷冻样品台、能量过滤器和直接电子探测器相机的300千伏透射电子显微镜，但也可使用配备侧插式冷冻样品台和CCD相机的200千伏仪器。观看本视频后，您应能够充分理解如何制备冷冻电镜载网、采集倾斜系列图像、重构断层图以及计算亚断层平均图。

这些是研究细胞内蛋白质的组织方式如何影响细胞执行生物功能（如高效ATP合成）的能力所需的基本技能。切记，操作液氮和液态乙烷可能存在极大危险，必须始终佩戴护目镜和手套。