腹膜来源肥大细胞的分离及其通过Ca²⁺-成像与脱颗粒实验进行的功能表征

这些方法有助于回答可兴奋细胞内信号传导领域中的关键问题，例如哪些离子通道对免疫细胞的活化及介质释放至关重要。这些技术的主要优势在于其相对简便性以及能够同时分析大量细胞。接下来将由本实验室的研究生 Kathrin Ohlenschlager 演示在肥大细胞中进行 Fura-2 钙离子成像的实验。

开始此操作时，用70%乙醇喷洒已处死的小鼠，并用针将其固定在泡沫板上，腹面朝下。使用钝头剪刀去除小鼠腹部的皮肤，注意避免损伤腹膜腔。接着，将27号针头小心插入腹膜，向腹膜腔内注射7毫升冰冻的RPMI培养基。

切勿刺穿任何器官，应选择附睾脂肪区域的部位进行注射，以降低器官穿孔的风险。注射后，轻轻摇晃小鼠一分钟，使腹膜细胞脱落至RMPI培养基中。摇晃时力度不宜过大，以免损伤内脏器官，并防止血液污染腹腔。

然后，更换新的20号针头，重复使用该注射器。通过倾斜泡沫块并轻轻在实验台上敲击，将内脏器官移至一侧，以便从另一侧更方便地吸取培养基。随后，将20号针头斜面向上插入，从腹部缓慢轻柔地吸取液体，避免因接触内脏器官而造成堵塞。

尽可能收集多的液体。然后，将针头从注射器上取下，将收集到的细胞悬液转移至预冷的收集管中，置于冰上。若样本管中可见血液污染，则弃用该样本管。

将含有纯净细胞悬液的离心管在300 g条件下离心5分钟。在无菌操作台内，吸除上清液。用冷的PMC培养基重悬样品沉淀，并将细胞悬液转移至25平方厘米的细胞培养瓶中。

随后，将生长因子 IL-3 和 SCF 分别加入至终浓度为 10 纳克/毫升和 30 纳克/毫升。将细胞在 37 摄氏度下孵育约 48 小时，直至进行下一步操作。在第 12 至 15 天，若计划进行质膜 IgE 受体刺激实验，则需在标准培养基中用 300 纳克/毫升的抗-DNP IgE 抗体对细胞进行过夜预处理。

为了准备Fura-2成像，将Fura-2 AM储存液用钙离子HBSS稀释至终浓度为5 µM，以制备负载缓冲液。然后，将500 µL负载缓冲液与500 µL PMC细胞悬液混合。将混合液移入成像室，并在室温避光条件下孵育20至30分钟。

根据刺激方案，使用不同的溶液设置重力驱动的给药系统。然后，将给药系统安装在倒置显微镜的载物台上。通过在高数值孔径的40倍油镜上放置一小滴浸油，完成物镜的准备工作。

将载有细胞的成像室放入应用系统中，并固定以防止记录过程中发生移动。然后，打开透射光并聚焦于细胞。随后，在生理学采集模式下启动成像采集程序。

打开设置窗口，调节焦距和最佳采集时间。拍摄参考图像，并将细胞标记为感兴趣区域（ROI）。在无细胞区域标记最后一个ROI，并将其定义为背景。

然后，完成设置并以每5秒一次的采集速率开始测量。接下来，根据实验设计在相应的循环次数时加入溶液。为检测抗原诱导的细胞内钙离子浓度升高，在第20个循环后加入2号注射器中的溶液，并在第150个循环后停止记录。

为了检测化合物48/80诱导的细胞内钙离子浓度升高，在第20个循环后加入注射器三中的溶液，并在第150个循环后停止记录。为了检测由SOCE引发的细胞内钙离子浓度升高，在第10个循环后加入注射器四中的溶液，在第70个循环后加入注射器五中的溶液，在第120个循环后再次加入注射器四中的溶液，在第150个循环后加入注射器一中的溶液，并在第220个循环后停止记录。在数据采集程序中，依次点击按钮：Start Cutter、Mark All、Convert All、Physiology Measurements、OK，然后再次点击OK。

将文件保存为表格和图像堆栈，以便进行离线分析。为检测β-己糖胺酶的释放，每孔加入100 µL细胞悬液至96孔V型底板中。向每孔加入25 µL刺激液或对照溶液。

然后，在37摄氏度下孵育细胞45分钟。之后，将96孔板置于冰上5分钟以终止反应。接着，在4摄氏度下以120 ×g离心4分钟。

将120微升上清液转移至平底96孔板中，并置于冰上。操作时需小心避免触碰细胞沉淀，但要彻底吸走上清液。接着，向细胞沉淀中加入125微升裂解缓冲液。

将细胞沉淀在室温下孵育五分钟，孵育结束后通过反复吹打重悬细胞。在新的平底96孔板的相应孔中加入25微升4毫摩尔的pNAG溶液。分别取25微升各上清液和25微升各细胞裂解液，加入已准备好的pNAG溶液中。

将反应体系在37摄氏度下孵育1小时。孵育结束后，用移液器向每孔加入150微升终止液以终止反应。随后，使用酶标仪在405纳米波长下检测各孔样品的吸光度，参考波长设为630纳米，以实现自动背景校正。

在采集程序中，勾选参考（Reference）选项，并在吸光度程序元素菜单中选择 630 纳米以进行自动背景扣除。通过β-己糖胺酶释放实验检测分离得到的肥大细胞在质膜IgE高亲和力受体交联或MrgPRB2受体刺激后发生脱颗粒的能力。将细胞加入V型底96孔板中，按照此方案在37摄氏度下刺激45分钟。

离心并去除上清液后，裂解沉淀物。随后通过各个上清液及沉淀裂解液在37摄氏度下与pNAG孵育1小时的反应，分析其中β-己糖胺酶的含量。反应产物的量通过比色法检测，并计算释放的β-己糖胺酶百分比。

自发释放水平非常低，而对强效脱颗粒刺激物的反应，如10微摩尔离子霉素和50微克/毫升的化合物48/80，分别超过40%和60%。对DNP刺激的脱颗粒反应在10至300毫克/毫升的浓度范围内呈剂量依赖性。综上，这些数据明确表明分离得到的PMC具有良好的功能状态。

利用该技术，您可在两周内获得高纯度的小鼠成熟结缔组织肥大细胞，这些细胞来源于腹膜。在进行该操作时，重要的是要注意在细胞分离和培养过程中保持无菌条件，以避免细菌污染。在完成该操作后，还可采用其他方法，如电生理膜片钳离子电流检测，以进一步探究肥大细胞中钙离子内流途径的相关问题。

在Fura-2细胞内钙成像技术发展之后，该技术为从事群体细胞生理学研究的科研人员探索肥大细胞脱颗粒的钙依赖性提供了重要途径。观看本视频后，您应能够充分掌握如何利用肥大细胞开展Fura-2钙成像实验以及β-己糖胺酶脱颗粒检测。请注意，紫外辐射可能对眼睛和皮肤造成危害，在进行本实验操作时应避免不必要的暴露。