利用基因工程HEK细胞筛选激活MRGPRX2的多肽

今天，我们将演示一种针对最近发现的主要受体——即 Mas 相关 G 蛋白偶联受体 X2（也称为 MRGPRX2 受体）——筛选肽库的方法。肥大细胞是免疫系统的重要组成部分，在先天性和适应性免疫反应中均发挥关键作用。肥大细胞可通过抗原结合的 Fc epsilon R1 受体或最近发现的 X2 受体被激活。

表面结合的X2受体的激活与多种免疫学和炎症性疾病相关，因此了解该受体与其配体的结合机制具有重要意义。为此，我们开发了一组小肽分子文库，并针对在晶状体上过表达的X2受体进行了筛选。在本研究中，采用丙氨酸扫描和氨基酸截短等简单且通用的技术构建了肽库。

Heck293细胞表达X2受体，在用多肽激活时，以野生型hexis作为对照。通过监测激活后的截短释放情况来研究基于X2的激活。实验中，使用Fura-2 AM钙敏感性染料，在340和380纳米处激发，发射光在510纳米处记录。

钙离子结合后，340 nm处的荧光强度增加，而380 nm处的荧光强度降低。随后，该染料的信号以340 nm与380 nm荧光强度的比值形式表示。340与380比值与细胞内钙离子浓度成正比，其数值可通过Grynkiewicz方程计算得出。

检测两种荧光强度的分选比率，以及稀释、光漂白、染料泄漏和气味密度等实验因素的影响。因此，不再耽搁，让我们开始实验。为了鉴定肥大细胞 MRGPR X2 受体的配体，通过截除 pam-12 促恶吐活性肽的 N 末端、C 末端以及 N+C 末端氨基酸，分别生成 N 端截短、C 端截短和 N+C 端截短的肽库。

采用固相肽合成法合成肽段。将N端修饰为乙酰基团，C端修饰为酰胺基团。通过将pam-12肽段中的各个氨基酸依次替换为丙氨酸，构建丙氨酸扫描肽库。

将末端修饰为硫醇基团，C端修饰为酰胺基团。通过在高糖DMEM中添加10%胎牛血清、2 mM L-谷氨酰胺、100单位/毫升青霉素和100微克/毫升链霉素来制备培养基。将细胞接种于组织培养处理过的T25培养瓶中，在37摄氏度、5% CO2条件下培养，直至细胞融合度达到75%至80%。

当细胞融合度达到75%时，洗涤细胞并加入2至3 ml Proof-C，以使细胞脱落。待细胞脱落后，用Proof-C收集细胞，并加入6至9 ml新鲜培养基。

以1620g离心3至5分钟。离心后，弃去上清液以收集沉淀。用新鲜培养基重悬细胞。

根据所需浓度稀释细胞。取200 µL浓度为200,000个细胞的细胞悬液，加入每孔，使每孔含有40,000个细胞。将细胞置于37°C、5% CO2培养箱中培养24小时。

实验中使用 Fura-2 AM 染料。将 50 微克 Fura-2 AM 加入 50 微升 DMSO 中，配制 1 毫摩尔的 Fura-2 AM 染料储备液。每毫升新鲜培养基中加入 1 微升 1 毫摩尔的 Fura-2 AM 染料，以制备染料浓度为 1 微摩尔的稀释培养基。

从培养箱中取出96孔板，弃去培养基，更换为新鲜的稀释培养基。每孔加入200 µL稀释培养基。

在37摄氏度、5% CO2培养箱中孵育细胞30至40分钟。在细胞孵育期间，设置酶标仪，将温度设定为37摄氏度。

在设置中选择 Flex。将读取模式设为荧光和底部读取。在波长设置中，将波长数量设为两个。

将激发波长设为 340 纳米和 380 纳米，发射波长设为 510 纳米。灵敏度保持默认设置。

在“定时”中，将间隔设置为 3.9 秒。将运行时间设置为 94 秒，以获得 25 次读数。接下来，选择检测板类型。

接下来，选择要读取的孔。在化合物转移步骤中，将转移次数设置为一次，初始体积设置为 100 µL。将移液高度设为 100 µL，体积设为 50 µL，时间点设为 36 秒，以加入化合物并进行读数。

接下来，选择化合物来源板类型。将“混匀”选项保留为“未使用”。选择移液头及移液头布局。

对于化合物列和吸头列，化合物将被转移至化合物板的第一列。将吸头列设置为1，化合物列设置为1。保持自动校准为开启状态。单击“确定”。孵育40分钟后，移除培养基。

用XDB缓冲液洗涤细胞。加入100 µL XDB缓冲液用于荧光检测。将培养板置于荧光检测仪中进行荧光读数。

当 pritchett 达到 37 摄氏度时，按压读数室，将检测板放入荧光酶标仪中。按压源端以放入化合物板。通过向 X 溶液中分别加入 200 µL 的相应肽、离子霉素和 EGTA 来制备化合物板。

按下吸头弹出按钮以放置吸头盒。使用黑色吸头以避免吸头自身产生自发荧光。待微孔板放置妥当后，使用软件设置并点击“读取”按钮。

利用 Grynkiewicz 方程根据荧光比值确定钙离子浓度。图中显示的是 pam good 肽的荧光数据。可以看出，在 36 秒加入肽后，340 纳米处的荧光（即发光强度）增加，而 380 纳米处的荧光记录则下降。

数据表示为340信号与380信号的比值。图中显示，加入肽后信号比值增加。该图为代表性数据，用于激活性肽的检测。

图A显示了激活肽的荧光信号。代表性数据对应于在完成震荡循环的基线建立后加入cram12肽，如ado所示。图B显示了在340纳米激发后的荧光发射强度与在380纳米激发后的荧光发射强度的比值。

该图是空白对照的代表性数据。图A显示了空白对照的荧光信号。如ado所示，在稀释基线后进行了10个喂养周期，并在此后加入了HTB。

图B显示了在340纳米激发后荧光发射强度与在380纳米激发后荧光发射强度的比值。该图为代表性的染料校准标准品数据。图A显示，在第10次读数时加入了离子霉素，如箭头所示，以获得钙结合状态下最大荧光信号。

在进行了20次读数后，向体系中添加了EGPA Triton X hundred，该操作由获得最小信号的ado所示。图B展示了在340纳米激发波长下的荧光发射强度与在380纳米激发波长下的荧光发射强度的比值。这些数值进一步代入Grynkiewicz方程，以计算细胞内钙离子浓度。

该图展示了代表性肽段的表征，以确认其序列和纯度。图A显示，代表性肽段序列WNK WAL的垂直质谱峰质量为857.90 道尔顿，该数值由质谱分析中的质荷比（m/z）所示。

图B显示，经HPLC确认，该肽的纯度为99%。该肽属于N端和C端截短肽文库。综上所述，本文所述方法简便且具有多功能性，可高效、灵敏地用于大规模钙基筛选。

然而，有多个因素决定了数据的质量，因此需要针对特定的细胞仪器系统优化其组成。谢谢。