利用流式细胞术对人体脂肪组织中的免疫细胞进行表征

本实验的总体目标是利用流式细胞术从人脂肪组织中分离基质血管组分，以对脂肪组织内存在的不同免疫细胞群体进行表型分析。该方法有助于回答代谢研究中的关键问题，例如哪些免疫细胞会在肥胖个体的脂肪组织中积聚，以及其积聚程度如何。该技术的主要优势在于，能够同时检测免疫细胞上的多种标志物，并实现对脂肪组织中这些免疫细胞的鉴定与定量分析。

尽管该技术可为脂肪组织炎症提供关键见解，但也适用于其他器官和组织。通常，初次接触该技术的研究人员主要面临基质血管细胞污染以及染色过程中细胞丢失的问题。我的两位博士生 Suzan Wetzels 和 Mitchell Bijnen 将执行该实验方案。

首先使用手术刀将一克脂肪组织活检样本切成约两平方毫米大小的碎块。将组织碎块转移至一个50毫升离心管中，并向样品中加入10毫升胶原酶溶液。将组织碎片在37摄氏度水浴中孵育60分钟，振荡频率为每分钟60个循环。

随后通过200微米滤网过滤至新的50毫升锥形管中。离心前用7毫升PBS冲洗滤网。然后使用移液器去除上清液，注意不要将整个移液器吸头浸入溶液中。

应清晰可见沉淀，并尽可能除去上清液，以避免脂肪细胞对基质血管组分造成污染。我们将基质血管细胞沉淀用5 mL新鲜PBS重悬，并通过70 µm细胞筛过滤至新离心管中。离心后，将洗涤后的基质血管组分沉淀在3 mL红细胞裂解缓冲液中冰上孵育5分钟。

然后加入7毫升PBS终止裂解，通过离心收集细胞。为对基质血管组分进行流式细胞术分析而染色时，将细胞沉淀重悬于90微升4°C的荧光激活细胞分选缓冲液（FACS缓冲液）中，并加入10微升人IgG以阻断非特异性染色。将细胞悬液分装至96孔V型底板的两个孔中，置于冰上孵育15分钟。

孵育结束后，用100微升FACS缓冲液洗涤每个样本，在离心结束后以流畅的动作将板倒置，不要拍打以去除上清液。在将板倒置前，请务必清楚看到板底部的沉淀，以防止细胞在操作过程中丢失。将第一个沉淀重悬于29.5微升抗体混合液中用于第一个FACS检测组，第二个沉淀重悬于23微升抗体混合液中用于第二个FACS检测组。

在避光冰浴30分钟后，每孔用150 µL FACS缓冲液洗涤细胞，并将细胞沉淀重悬于150 µL 1%甲醛溶液中进行固定。将每孔中的细胞悬液转移至相应的FACS管中，并将样品置于冰上。在分析前，先将一份未染色的阴性对照样品上机，用于设定流式细胞仪的前向散射光（FSC）和侧向散射光（SSC）参数。

然后根据流式细胞仪制造商的说明调整电压，直到前向散射和侧向散射图中均可见所有目标细胞群，并能区分碎片与活细胞。当所有参数设置完毕后，将第一个实验样品在800 rpm下涡旋振荡，充分重悬细胞，随后将样品加载至细胞仪上。在活细胞门内至少采集50,000个事件，然后按照上述方法涡旋并加载第二个样品进行分析。

为了在本代表性实验中分析脂肪组织巨噬细胞群体，排除了其他免疫细胞，如T细胞、B细胞、中性粒细胞和自然杀伤细胞，以明确CD11b+CD11c+巨噬细胞、CD11B+CD11C-巨噬细胞以及CD11Blow-CD11C+树突状细胞的存在。对这些细胞的主要荧光强度进行定量分析，结果显示CD11B+CD11C+和CD11Blow-CD11C+细胞均表达浆细胞样树突状细胞和通用树突状细胞标志物，且CD11Blow-CD11C+细胞中这两种标志物的表达水平更高，证实CD11Blow-CD11C+细胞确为树突状细胞。对CD45阳性细胞设门分析，可识别出CD19阳性的B细胞和CD3阳性的T细胞群体，后者可进一步细分为CD3+CD4+辅助性T细胞和CD3+CD8+细胞毒性T细胞亚群，以及CD3-CD56+自然杀伤细胞。

随后计算每位受试者的活免疫细胞百分比，结果显示肥胖成年男性受试者内脏脂肪组织中促炎性CD11B+CD11C+巨噬细胞的比例显著增加。一旦掌握，若操作得当，该技术可在四小时内完成。进行此操作时，必须将缓冲液和细胞组分置于冰上；在用抗体标记细胞时，必须始终避光操作。

该技术建立后，使得代谢研究领域的研究人员能够探索人类脂肪组织中免疫细胞的变化。观看本视频后，您应充分了解如何分离脂肪组织中的免疫细胞，以及如何对这些细胞进行流式细胞术分析。请务必注意，您所操作的可能为具有感染性的生物材料，以及甲醛等有害物质，存在潜在危险。

始终采取预防措施，佩戴手套和安全眼镜。