高维流式细胞术用于分离的植入物组织免疫功能分析

该方案可帮助我们表征宿主针对不同生物材料的免疫反应，进而为设计更优的未来医用植入物提供支持。流式细胞术可提供有关浸润生物材料的免疫细胞的信息，有助于我们确定细胞对损伤和材料植入的响应机制，以及改进治疗策略的靶点。该相同方案可经修改后用于在不同条件下表征免疫反应。

取一周前接受 ECM 植入的小鼠的股四头肌，将其收集至含有 5 毫升无血清培养基的 50 毫升离心管中。最后用剪刀将组织剪碎。接着，向管中加入 5 毫升消化酶培养基。

将含有消化液和剪碎组织的离心管放入摇床培养箱中，在 37 摄氏度、100 RPM 条件下孵育 45 分钟。孵育结束后，将消化后的组织悬液通过 70 微米细胞筛过滤至单独的 50 毫升离心管中。使用 5 毫升注射器头碾压任何残留的组织块，并用室温 PBS 冲洗细胞筛。

弃去滤网中剩余的任何残留物，用室温 PBS 将离心管体积调至 50 毫升。通过离心收集细胞，并将沉淀重悬于 10 毫升冷的 PBS 中含 5 毫摩尔/升 EDTA 的溶液中。如果样品中存在血细胞，则将沉淀重悬于 1 毫升红细胞裂解缓冲液中，孵育 10 分钟，然后加入 9 毫升 EDTA 溶液。

将悬液置于冰上静置10分钟。然后用预冷的PBS调整体积至50毫升。通过离心收集细胞，并将沉淀重悬于100微升预冷的PBS中。

取10微升悬浮液转移至各个微量离心管中，加入10微升Trip和蓝色染料混匀用于计数。将剩余体积的细胞分装至96孔V型底培养板的各个孔中。从孔中取出20微升细胞，加入新的孔中作为未染色对照。

然后用 PBS 将每孔的终体积调至 200 微升。通过离心将细胞收集到板孔底部，并将细胞重悬于每孔 100 微升、浓度为 1:1000 的活率染料中。孵育结束后，用 100 微升新鲜 PBS 洗涤每孔，并将沉淀重悬于每孔 200 微升染色缓冲液中。

第二次离心后，将细胞重悬于50微升单核细胞阻断剂的一至一百倍稀释液中。将细胞悬液置于冰上孵育5分钟，然后加入50微升抗体混合液。避光冰上孵育30分钟。

然后每孔加入100微升染色缓冲液洗涤孔板。再次离心细胞，并用200微升染色缓冲液洗涤。重复此过程两次，最后将细胞重悬于400微升染色缓冲液中。

在分析样本之前，先运行未染色样本，以便在侧向散射与前向散射图上调整细胞群体。接着运行染色样本，提取自发荧光信号。

然后导入FCS文件，将其用作解混的对照。点击解混图标以打开解混向导，并通过圈选单色对照中的阳性与阴性细胞群，使用所有单色对照进行解混。接下来，点击质控（QC）部分，查看复杂性指数。

复杂度指数用于衡量一组光谱特征在解混后彼此之间可区分的程度。最后，通过点击实时解混来对样本进行解混。此处可以观察到14色流式细胞术在对照小鼠组织上的结果。

在此分析中，可观察到多个白细胞亚群，例如ly6g阳性的中性粒细胞以及ly6c中等和高表达的单核细胞亚群。当以CD11b设门以排除巨噬细胞及其他髓系谱系细胞（如中性粒细胞和单核细胞）时，CD11c高表达且MHC II阳性的树突状细胞清晰可见。通过聚焦于CD11c阳性细胞群，可鉴定出一群CD206阳性且CD86阳性的树突状细胞亚群，该群体包含CD86高表达的M1样树突状细胞和CD206高表达的M2样树突状细胞。

F4/80 的表达呈现梯度分布，这在多种巨噬细胞群体中通常可见。Siglec-F 存在于 F4/80 阳性和阴性细胞群体中，很可能分别对应巨噬细胞的一个亚群和嗜酸性粒细胞。尽管使用细胞表面标志物染色可实现对细胞类型的上述划分，但需要注意的是，应从功能角度而非简单的二元分类方式来理解表达不同标志物的细胞。

在尝试本方案时，需注意：在设计检测方案之前，充分了解未染色样本的自发荧光特征，是获得更佳检测效果和多重检测组合的关键。除用于细胞分析外，分离得到的细胞还可分选为特定细胞群，用于后续的细胞功能检测、体外实验、转录组分析，或进行显微镜观察以评估细胞形态。生物材料流式细胞术分析的日益复杂化，有助于弥合基础免疫学研究与新型治疗药物开发之间的差距。