利用Cas9核糖核蛋白在多种细胞和生物体中实现增强的基因组编辑

本实验方案的总体目标是利用CRISPR/Cas9核糖核蛋白复合物，在多种细胞和生物体中实现靶向基因组编辑。该方法使研究人员能够在模式生物和非模式生物的未经修饰基因组中，定制化地引入插入、缺失和替换，从而有助于解答基本的生物学问题。与使用质粒DNA相比，采用核糖核蛋白（RNP）复合物的主要优势在于编辑效率更高，且脱靶效应更少。

该技术的应用前景可拓展至用于对抗癌症、艾滋病病毒（HIV）或遗传性疾病等疾病的离体治疗。这是因为基因组编辑可用于纠正有害的基因突变，甚至增强细胞抵抗有害疾病的能力。因此，该方法可为研究人类原代细胞、秀丽隐杆线虫（C.elegans）以及夏威夷短额虫（Parhyale hawaiensis）提供重要见解。

该方法可应用于数百种其他系统中的基因改造，包括此前难以处理的生物体。按照文本方案中所述，首先设计并制备向导RNA。将向导RNA以一到两倍摩尔量与200皮摩尔Cas9蛋白在总体积为10微升的溶液中混合，组装成RNP复合物。

非常缓慢地将浓缩的 Cas9 加入向导 RNA 中，持续约 30 秒，同时用移液器快速画圈混匀，使最终的 Cas9 浓度达到 20 微摩尔（µM）。接下来，向每个电穿孔杯孔中加入 10 微升（µL）RNP 复合物。

按照文本方案制备造血干细胞和祖细胞（HSPCs）后，使用血细胞计数板对细胞进行计数，并将每管150,000至200,000个细胞转移至电穿孔用比色皿，随后转入离心管中。以100 × g离心10分钟，使细胞沉淀。使用移液器或真空装置吸除上清液，注意去除任何气泡。

每比色皿孔中加入 20 微升电穿孔缓冲液，轻柔重悬细胞。然后，向已含有 10 微升 RNP 的每个比色皿孔中加入 20 微升细胞，细胞数量为 150,000 至 200,000 个 HSPC，并通过上下吹打充分混匀，避免产生气泡。最后，将比色皿放入核转染仪中进行电穿孔。

对于HSPCs，使用脉冲程序ER-100。按照文字方案中的描述，开始制备琼脂糖载片上的秀丽隐杆线虫。将琼脂糖注射载片和盖玻片置于解剖显微镜下。

使用线虫挑取工具沿垫片的一边涂抹少量卤代烃油。然后，用涂有油的线虫挑取工具将多条线虫从NG琼脂平板上挑起，并放入油迹中。使用连接在移液管上的细毛（如睫毛或猫须），将线虫并排排列，并轻轻推动线虫使其接触琼脂糖垫。

在尚未熟练掌握显微注射操作之前，每次仅固定并注射一条线虫。将线虫放置到位并附着于载片垫上后，用挑虫针尖端滴加数滴卤代烷油覆盖线虫。将载有固定线虫的盖玻片置于显微注射镜下。

在低倍镜下，将线虫垂直于注射针摆放，针内已按文本方案说明装入RNP溶液。切换至高倍镜，重新调整针的位置，使其紧邻性腺臂，对应于中期至晚期粗线期细胞核附近的区域。使用显微操作器，将注射针推向线虫，轻微下压角质层。

然后，用一只手轻敲显微镜载物台侧面，使针头刺穿角质层。按下注射踏板或按钮，缓慢将注射混合物注入另一侧的性腺臂，然后取出针头。对另一侧的性腺臂重复此步骤。

注射完成后，移去盖玻片和琼脂糖垫，将样本置于解剖显微镜下。使用拉制的毛细移液管，通过在样本上滴加M9缓冲液，将覆盖在蠕虫上的油置换掉。进行此处理以使蠕虫从琼脂中释放出来。

10 分钟后，当线虫在缓冲液中剧烈翻滚时，使用拉制的毛细移液管将其转移到含有 OP50 细菌的 NG 琼脂平板上。将平板置于 20 摄氏度环境中 2 至 3 小时，直至线虫恢复活动并开始爬行。恢复后，将线虫逐个转移至含有 OP50 细菌的 NG 琼脂平板上。

然后，将培养皿转移至25摄氏度的培养箱中。通过使用0.02%丁香油和海水对怀卵雌性个体进行麻醉，收集受精后0至4小时的单细胞Parhyale胚胎。使用火焰拉制并磨圆的玻璃移液管以及钝头3号镊子，轻轻将胚胎从其腹侧育卵囊中刮出。

使用压缩氮气，在解剖显微镜下利用显微注射仪和显微操作器对 Parhyale 胚胎进行注射。用移液器吸头将 1.5 µL 注射混合液吸入拉制好的毛细管后端。将注射针安装到注射装置上后，在解剖显微镜下用镊子折断针尖。

通过将液体注入700号卤代烃油并测量气泡直径，校准递送体积。使用剃刀片从固化剂中切出一条槽，加入过滤除菌的海水至半满，将Parhyale胚胎排列于槽中以进行显微注射。

使用显微注射装置注射胚胎，在注射过程中用一对镊子固定每个胚胎。注射后，用玻璃转移移液管将胚胎转移至盛有半量滤膜除菌海水的新鲜60毫米培养皿中，随后在不同发育阶段对胚胎进行解剖和固定。通过将一段长约0.5英寸的弯曲钨丝插入胰岛素针头末端，制备解剖针。

使用一个1毫升的注射器作为解剖针的手柄，并在电流作用下于氢氧化钠溶液中将针尖 sharpen。取一个三孔玻璃培养皿，将其中一孔加满新鲜配制的固定液，该固定液由9份PEM缓冲液、1份10X PBS和1份32% PFA组成，液面加至孔的一半。将3至5个胚胎放入培养皿中，用锋利的钨针在每个胚胎上刺出一个小孔，同时用稍钝的针固定胚胎以保持稳定，使卵黄流出，固定液进入胚胎内部。

使用一对锋利的钨针，轻轻剥离包裹在 Parhyale 胚胎外侧的两层膜。在固定液中进行解剖，以使胚胎更加坚固，但操作需迅速，防止膜与胚胎固定在一起，否则会增加去膜难度。抗体染色时，胚胎固定总时间为 15 至 20 分钟；原位杂交时，固定时间为 40 至 50 分钟。

有时，通过实验检测来评估基因编辑实验的结果最为合适。此处展示了野生型T细胞和CD25基因敲除细胞的代表性结果。流式细胞术结果显示，未使用Cas9核糖核蛋白（RNP）进行编辑的细胞表达CD25。

然而，CD25基因被敲除的细胞不表达该蛋白。对于大规模扰动，编辑结果可能具有明显的视觉表型。例如，野生型夏威夷短额虫具有正常的腹部，并具备用于游泳和固定的附肢。

破坏 Abd-B 基因会将腹部的游泳足和锚定足转变为跳跃足和行走足，而后者通常仅与胸部相关。除了观察表型外，实验人员还应分析基因型，以评估整体编辑效率并检测特定的遗传改变。对于单个克隆，可通过简单的桑格测序实现。

在细胞混合群体中，建议采用更高级的测序分析方法。例如，TIDE 可以绘制出 RNP 编辑群体中各个细胞内发生的所有不同插入缺失（indel）图谱。初次尝试该实验流程时，建议使用我们在表一中列出的阳性对照之一。

使用经过验证的引导 RNA 可以帮助您在设计自己的实验之前，熟悉 RNP 编辑的操作。