利用无缝基因组编辑技术在人类多能干细胞中引入点突变

在人类多能干细胞中进行基因编辑具有挑战性。本方案详细介绍了利用成对的Cas-90核酸酶结合靶向载体在这些细胞中进行基因组编辑的具体步骤。该方法可靠且易于操作。

本方案的主要优势在于其能够实现无缝的基因组编辑。两步筛选法有助于增加靶向细胞的比例，使基因分型筛选更加高效。在mTeSR1培养基中，将人多能干细胞培养于重组层粘连蛋白211（laminin 211）编码的表面。

细胞应在1:3传代后72小时达到70%至85%的融合度。转染当天，用300微升层粘连蛋白521溶液包被24孔板中足够数量的孔，并在37摄氏度孵育至少2小时。孵育结束后，轻轻去除包被溶液，并立即向每孔加入含10微摩尔ROCK抑制剂的300微升新鲜mTeSR1培养基。

然后将培养板放回培养箱中。从培养箱中取出储备的人类多能干细胞。移除用过的培养基，并用一毫升无菌 DPBS 清洗细胞一次。

然后向每个孔中加入1毫升温和的细胞解离试剂，在37摄氏度下孵育6至8分钟以解离细胞。轻轻敲击培养板，确保细胞能够轻松脱落。随后使用P1000枪头通过上下吹打来悬浮细胞。

加入2毫升含ROCK抑制剂的mTeSR1培养基以终止消化。充分混匀悬浮液，并转移至50毫升离心管中。在200 ×g离心3分钟。

然后去除上清液，并将细胞重悬于含有ROCK抑制剂的2毫升mTeSR1培养基中。使用血细胞计数板和台盼蓝对细胞进行计数。每份核转染反应将80万至100万个细胞转移至1.5毫升离心管中，并在200 ×g下离心3分钟。

然后小心吸除上清液。将3微克配对的Cas-9n单引导RNA表达质粒和5微克靶向载体质粒加入100微升人干细胞核转染试剂盒中的混合核转染溶液中并混匀。同时制备一个GFP对照质粒混合物。

将细胞用DNA混合物重悬，并转移至电穿孔比色皿中，注意避免产生气泡。使用优化的人多能干细胞条件，用核转染装置对细胞进行电穿孔。电穿孔后立即向细胞中加入500微升新鲜且预热的mTeSR1培养基，培养基中需添加10微摩尔ROCK抑制剂。

然后将混合物转移至预先准备好的24孔板中的两个孔内。将该板放入含有5%二氧化碳的37摄氏度培养箱中，使细胞恢复。在12至16小时后更换细胞维持培养基，若细胞已形成细胞间接触，则去除ROCK抑制剂。

转染后24至48小时，通过检测对照细胞中GFP的表达来评估核转染效率。转染48小时后，在mTeSR1培养基中加入1微克/毫升嘌呤霉素，开始筛选细胞。72小时后，将培养基中的嘌呤霉素浓度调整为0.5微克/毫升。

如果细胞汇合度低于30%，还需在培养基中添加10微摩尔的ROCK抑制剂。转染后4至6天，将嘌呤霉素抗性细胞以每孔0.8个细胞的浓度传代至10至15个96孔板中。确保在培养基中补充ROCK抑制剂和嘌呤霉素。

将细胞在 37 摄氏度、10% 二氧化碳条件下培养 10 至 12 天，以形成单细胞来源的克隆。接种后第 7 天补充培养基。标记含有单个克隆的孔，并将培养基更换为新鲜的 mTeSR1 培养基，其中含有 0.5 微克/毫升嘌呤霉素，但不含 ROCK 抑制剂。

在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳条件下继续培养细胞两天。然后更换含有未分化集落的孔中的培养基。轻轻刮下集落，并将一个集落的细胞悬液转移至两个新的 96 孔板中的两个新孔内。

一份用于基因分型，另一份用于维持培养。当基因分型细胞的融合度达到50%或以上时，弃去旧培养基，用DPBS洗涤细胞一次。使用Bradley裂解缓冲液裂解细胞，并从每个孔中分离基因组DNA。

在完成三次引物连接PCR并测序产物后，保留基因型正确的菌落，弃去其余菌落。在持续嘌呤霉素筛选条件下扩增正确的菌落，并在尽可能早的传代阶段进行冻存。本实验方案用于在肝细胞核因子4α基因的第8外显子中引入两个点突变。

采用基于三种引物的PCR方法筛选正确靶向的细胞，并通过Sanger测序验证PCR结果。在去除筛选盒后，再次对修饰区域进行测序，以确认目的点突变的正确引入。选择具有正确基因型的菌落，并在进一步分析前对细胞进行表征。

经编辑的细胞具有与亲本细胞相同的形态，并表达代表性的人类多能干细胞标志物，包括转录因子 Nanog 和 Oct4，以及细胞表面标志物 SSEA-4 和 TRA-1-60。在进行该操作时，需注意在嘌呤霉素筛选后的最初24小时内检查细胞汇合度。必须在培养基中添加ROCK抑制剂。

如果细胞融合度低于30%，需继续培养以维持细胞生长。一旦建立基因组编辑的多能干细胞系，便可用于研究基因功能或定向分化。该技术为研究人员探索各类科学问题提供了途径，例如基因的特定功能，或针对遗传性疾病的靶向基因校正。