脂质丰度的定量与脂质分布的评估 秀丽隐杆线虫 通过尼罗红和油红O染色

这些染色方法的总体目标是定量细胞内脂质含量，并评估不同组织间的脂质分布。该方法有助于回答脂质代谢领域的关键科学问题，例如脂质如何在遗传和生化层面受到调控，以及哪些疾病状态会影响脂质稳态的调节。该技术的主要优势在于操作相对简单且成本较低。

进行尼罗红脂质染色时，将线虫接种于涂有对数晚期OP50大肠杆菌的线虫生长培养基（NGM）平板上，在20摄氏度下培养至早期L4阶段。用1毫升PBST溶液清洗线虫，并将线虫悬液转移至1.5毫升微量离心管中。以560 × g离心1分钟。

然后去除上清液，并重复使用PBST洗涤，直至悬浮液中的大肠杆菌被完全清除。接下来，向线虫沉淀中加入100微升40%异丙醇（或进行ORO染色时使用60%异丙醇），室温孵育3分钟。在染色前加入异丙醇对于线虫的适当通透化至关重要。

将线虫在560 × g 条件下离心1分钟，并在不扰动线虫沉淀的情况下移除上清液。在离心过程中应尽量减少光照暴露。现在，在避光条件下，向每个样品中加入600 µL预先配制好的NR工作液。

将试管倒置三次，充分混匀线虫与溶液。随后将样品在室温下避光孵育两小时。孵育结束后，离心线虫并弃去上清液。

然后加入 600 µL PBST，将样品在避光条件下孵育 30 分钟，以去除多余的中性红染料。再次按前述方法离心样品后，弃去上清液，仅保留约 50 µL，将虫体沉淀在剩余溶液中重新悬浮。为制备成像用载玻片，用移液器吸取 5 µL 虫体悬浮液滴加到显微镜载玻片上，小心地加盖盖玻片，避免产生气泡。

使用 FITC GFP 通道对经 NR 染色的线虫进行成像，并尝试不同的曝光时间，在五倍放大倍数下对每视野中的多个个体进行成像。随后切换至十倍放大倍数，以更精确地对单个线虫进行定量分析。为实现图像定量，将显微图像上传至 ImageJ。

在图像下拉菜单中，调节图像序列的亮度和对比度，然后点击“应用”以将更改应用到所有图像。使用多边形选择工具勾勒出每条成像的线虫，然后在分析下拉菜单中使用“测量”功能来定量NR发出的荧光强度。对每幅图像，测量五个背景区域，并计算平均背景荧光强度。向每个样品中加入600 µL油红O（Oil Red O）或ORO工作液，倒置离心管三次，充分混匀线虫与ORO。

将样品在30 RPM和室温下旋转2小时。以560 ×g离心1分钟，吸除上清液，仅保留100微升。然后加入600微升PBST重悬样品，并在30 RPM下旋转30分钟，以去除多余的ORO染色。

为了更清晰地区分动物生殖系在肠细胞中的位置，可在每毫升ORO工作液中加入一微升DAPI对细胞核进行染色。随后，为制备成像用载玻片，重新悬浮线虫及剩余的上清液，并充分混匀溶液。取五微升线虫悬浮液置于显微镜载玻片上，小心加盖盖玻片，确保不产生气泡。

为了成像经 ORO 染色的线虫，使用具备彩色成像能力的相机在五倍放大倍数下对一个视野中的多条线虫进行成像。随后切换至十倍放大倍数，以便更详细地观察单条线虫。最后，在将图像上传至 ImageJ 并根据文本方案创建图像序列后，依据整个动物体内或特定组织中的脂质积累情况对图像进行分类。

SKN-1 与哺乳动物的 Nrf2 具有同源性，并已被证明可介导脂肪酸氧化。该图显示了在导致脂质水平升高的条件下，SKN-1 激活的动物。如图中所示，使用 FITC GFP 通道捕获的 NR 荧光在肠道区域明显较强，而在头部、尾部和肠腔中较弱。

尽管可以根据是否存在年龄依赖性体细胞脂肪耗竭（Age-dependent Somatic Depletion of Fat，ASDF）来对线虫进行分类，但识别具有中度脂肪减少的个体可能较为困难。与非ASDF个体相比，后者在整个身体范围内呈现明亮的红色染色，仅有少量半透明区域，而ASDF线虫则在肠细胞中表现出明显的脂肪减少。正在发展为ASDF的个体通常会显示出半透明斑点，这些区域即为最终发生大部分脂肪减少的部位。

此外，ASDF 蠕虫的头部和尾部区域可能仍呈现明亮的红色染色，因为该表型并非由完全的体脂丧失定义，而是相对于未衰老的动物表现出显著的脂肪耗竭。一旦掌握，若操作得当，该技术可在三小时内完成，另需加上成像时间。在进行此操作时，需注意在染色前不超过 30 分钟内对蠕虫进行清洗和通透处理。

完成此操作后，可进一步采用其他方法（如CARS显微镜）进行比较，以分析不同技术所识别的脂质种类，并确定哪种方法更适合特定类型的研究问题。观看本视频后，您应能够充分掌握如何利用尼罗红和油红O染色结合ImageJ显微图像分析，对线虫中的脂质进行定量并评估其分布情况。