检测多拷贝质粒在抗生素耐药性进化中的作用

本实验方法的总体目标是验证多拷贝质粒在抗生素耐药性进化过程中的作用。该方法有助于回答微生物学领域中的一些关键问题，例如多拷贝质粒在细菌新功能进化中的作用。该技术的主要优势在于仅需基本的分子生物学方法和简单的实验设计。

这非常巧妙。首先，构建携带抗体抗性基因的大肠杆菌 MG1655 菌株，该基因将位于染色体上λ噬菌体的 ATTB 位点处。为此，通过 PCR 扩增 ATTB 位点两侧各 500 个碱基对的区域。

然后通过PCR扩增抗生素抗性基因。接着在50摄氏度下进行30分钟的等温组装，将同源区域与PCR产物连接。等温组装完成后，取1微升产物加入到含有40微升电转感受态MG1655细胞的2毫米比色皿中。

然后在4摄氏度、2.5千伏条件下对细胞进行电穿孔。电穿孔后，将细胞转入含有0.2%阿拉伯糖的一毫升LB肉汤中。接着用移液器将含有细胞的LB肉汤转移至微量离心管中。

在30摄氏度下剧烈振荡试管两小时。两小时后，取100微升培养物涂布于添加了抗生素的LB琼脂平板上。随后离心收集剩余的菌体细胞。

将沉淀重悬于100微升新鲜LB肉汤中。将这些细胞重新涂布到另一块LB琼脂平板上。然后在42摄氏度下过夜培养平板。

第二天，使用外部引物 ybhC extern 和 ybhB extern 对克隆进行 PCR 扩增，以验证构建体。然后通过琼脂糖凝胶电泳确认扩增片段的大小。同时，进行DNA测序以验证插入基因的序列。

为了构建在多拷贝质粒中携带抗体抗性基因的菌株，首先通过PCR扩增抗生素抗性基因blaTEM-1。PCR完成后，使用T4多聚核苷酸激酶对扩增产物进行磷酸化处理。接下来，使用高保真聚合酶以及寡核苷酸PBAD FINV和PBAD RINV，对PBAD质粒骨架进行PCR扩增。

然后使用T4连接酶将两个PCR片段连接。接着，用1微升连接产物电转化40微升DH5 alpha感受态细胞。随后，在含有适当抗生素的琼脂平板上根据抗生素抗性基因和质粒骨架筛选阳性克隆。

然后使用DNA提取试剂盒，按照制造商说明书进行质粒提取。接着对目标耐药基因进行Sanger测序，以确认在进化实验前不存在任何可能的突变。序列验证完成后，将质粒通过电转化转入大肠杆菌MG1655菌株，最终获得携带该质粒的MG1655菌株。

本方案中最关键的步骤是构建模型系统菌株以及重建在实验进化过程中观察到的突变。首先，将感兴趣的 MG1655 菌株划线接种于 LB 琼脂平板上。然后在 96 孔板的每个孔中加入 200 微升 LB 培养基。

接下来，将每种菌株的48个独立菌落分别接种到平板中各个孔内。接种后，将平板置于37摄氏度、200转/分钟的摇床上过夜培养。随后，从每个孔中取2 µL培养物，与原始菌群一起接种至新的96孔板中，每孔含有198 µL LB培养基。

这将启动进化拯救实验。将培养板置于37°C、200转/分钟的摇床上孵育20小时。每天将抗生素浓度设置为前一天浓度的两倍。

第二天，将相应培养物的 2 微升转移至新的 96 孔板中，并每天持续进行此操作。使用酶标仪记录各孔在 600 纳米处的光密度读数。该实验方案的关键步骤是实验性进化及其抗生素浓度的逐步增加。

抗生素浓度的变化速率是可被改变以促进抗生素耐药性进化的参数之一。再次将平板置于37摄氏度、200转/分钟的摇床上培养20小时。随后每天使用酶标仪测量平板上每个存活菌群在600纳米处的光密度读数。

每隔三到五天定期冷冻保存菌群。从进化后的菌群以及不同菌株和处理组的克隆中提取总DNA。接着，使用分光光度计测定260:280和260:230纳米处的吸光度比值，以评估DNA的质量。

然后使用荧光DNA结合染料，并通过酶标仪测量荧光值来确认DNA的浓度。此外，对DNA进行琼脂糖凝胶电泳，以确认无DNA降解或RNA污染。接着，对来自全群体和单个克隆的样品进行深度DNA测序，以研究抗生素耐药性的遗传基础。

本研究展示了利用三种大肠杆菌菌株进行实验系统的可能结果。这些菌株分别为大肠杆菌MG1655、染色体中携带耐药基因的MG1655 resA，以及在多拷贝质粒中携带耐药基因的MG1655 pRESA。所使用的抗生素为头孢他啶和美罗培南。

左侧面板显示了在头孢他啶浓度逐渐增加条件下的生存曲线。从图中可以看出，菌株 MG1655 pRESA 的部分群体即使在每天头孢他啶浓度加倍的情况下，仍能生长超过 14 天。相反，在暴露于相似浓度的头孢他啶时，其他菌株在 8 天后均无法存活。

然而，当暴露于另一种抗生素美罗培南的相似浓度时，这些菌株在存活时间上并未表现出显著差异。当暴露于美罗培南时，所有三种菌株的存活时间仅为6至8天。这表明，resA基因存在于多拷贝质粒中可增强对头孢他啶耐药性的进化，但不能增强对美罗培南的耐药性。

一旦掌握，若操作得当，整个实验方案可在数周内完成。观看本视频后，您应能充分理解如何研究多拷贝质粒在细菌新功能进化中的作用。