实验进化方法中质粒介导的抗生素抗性定量分析

质粒是染色体外的遗传元件，广泛存在于大多数细菌物种及其生境中，作为横向基因转移的重要媒介，能够在细胞之间以及种群之间迁移。此类基因转移最显著且典型的例子之一，便是由质粒编码的抗生素抗性基因的传播。为了构建一个编码抗生素抗性基因的模型质粒，需选择一种质粒骨架，并使用高保真DNA聚合酶及能与质粒模板结合的引物，通过PCR扩增该骨架。在本实验中，我们采用了pBBR1质粒骨架。接下来，使用高保真DNA聚合酶扩增包含天然Tn5启动子的抗性基因nptII。设计抗性基因的引物时，应使其具有约20个碱基与质粒骨架序列互补。PCR完成后，将纯化的抗性基因PCR产物的同源区域与纯化的质粒骨架通过50°C恒温组装反应融合60分钟。将融合产物通过电穿孔法转化至大肠杆菌DH5-Alpha中。取100微升转化混合物涂布于选择性培养基平板上，37°C培养约24小时。随后可提取质粒，进行验证，并将其转化至大肠杆菌野生型菌株MG1655中，获得菌株MG1655 pCON。在抗生素存在条件下，细菌需要该质粒才能存活，因此质粒处于正向选择压力下；而在非选择性条件（即无抗生素）下，质粒对细胞而言是可有可无的。本研究的目标是在这种非选择性条件下，长期追踪质粒的动态变化。为此，我们将小型质粒携带抗生素抗性基因并导入大肠杆菌（Escherichia coli），开展进化实验，并通过影印平板法监测质粒频率。携带质粒的菌株MG1655 pCON现被用于进化实验。首先，在添加抗生素的LB琼脂平板上涂布MG1655 pCON，37°C过夜培养。从该平板上随机选取8个祖先菌落，于37°C恒温振荡培养过夜。次日，将这些种群转移至96深孔板中进行实验。在此过程中，必须将重复样本在平板上随机分布，例如采用棋盘式布局。在本实验中，培养物以不同的稀释倍数和两种温度条件进行稀释和转移。每次传代时均施加相应的稀释处理，连续传代共98次。在整个进化实验过程中，通过携带质粒的细胞比例来估算种群中质粒的频率。影印平板法由Esther和Joshua Lederberg于20世纪50年代推广，他们曾利用该方法研究细菌的药物抗性。该方法使研究人员能够大规模筛查表型，最终发现青霉素抗性可由基因组中的自发突变引起。为确定实验过程中种群内质粒的频率，需将处于稳定期的培养物进行系列稀释后涂布于非选择性的LB琼脂平板上。调整稀释度，使每块平板上长出250至500个菌落为宜。将涂布后的平板于37°C培养过夜，时间少于24小时。菌落较小时最适宜进行影印。过夜培养后，使用任意型号的自动菌落计数器统计所有菌落数量，以获得培养物中的总细菌数量。注意应排除平板边缘的菌落。进行影印操作时，需准备添加抗生素的选择性琼脂平板、一个圆形木块、一个适配木块的金属环以及无菌的丝绒布。丝绒布必须为100%棉质，以便通过高压灭菌进行消毒。将丝绒布平铺于木块上，并用金属环固定。小心地将已计数菌落的平板倒置于固定的丝绒布表面，以环形轻压方式轻敲平板，确保整个平板表面均接触丝绒布。至关重要的是，所有菌落都必须接触到丝绒布。移去LB平板后，将选择性平板置于丝绒布上，再次小心轻敲，同样需确保整个平板完全接触丝绒布。随后移去选择性平板。将平板于室温下过夜培养。次日，需同时使用LB平板和抗生素平板进行结果判读。将两块平板叠放对比，可清晰观察到无菌落生长的空白区域。这些区域对应的菌落不具有抗生素抗性，即已丢失质粒。最终，统计抗生素平板上缺失的菌落数量，该数值即反映质粒丢失情况。在整个进化实验期间，需每周对所有种群重复一次影印平板操作。质粒丢失可能由质粒多联体形成异常所致。在进行质粒构建时，例如为在特定宿主菌株中表达某个目标基因，质粒在体内所呈现的构象状态通常容易被忽视。然而，在进化背景下，此类构象变化可能具有极其重要的意义。质粒构象的分析是一项极具挑战性的工作。尤其是质粒多联体难以通过PCR或测序方法准确识别。另一方面，由于质粒多联体可能具有较大分子量及较慢的电泳迁移率，也难以通过凝胶电泳有效分析。本实验方案提供了一种简单直接的方法，可用于筛查和鉴定任意质粒制备样品中的质粒多联体。为观察质粒分子，需从5 mL处于稳定期的过夜培养细胞中提取质粒DNA，采用碱裂解法进行提取。低拷贝数质粒的提取常伴随宿主染色体DNA污染，因此在可视化前需将其消化去除。为消除染色体DNA污染，使用Plasmid-Safe