通过无标记荧光显微镜评估活体人阻力动脉中胶原蛋白和弹性蛋白的压力依赖性微结构

本方法的总体目标是提供一种标准化流程，用于获取活体人类阻力动脉的图像，以分析细胞外基质微细结构与动脉壁力学特性之间的关系。该方法有助于回答血管生物学与血管力学领域的一些关键问题，例如压力如何引起血管壁整体几何形态及其微细结构的变化。该技术的主要优势在于成像过程中无需对样本进行标记。

尽管该方法可为阻力动脉的力学特性提供见解，但该方案的改进版本也可应用于其他管状器官，如支气管，或应用于人膀胱组织条或肠壁组织。首先，在手术切除后立即收集感兴趣的组织样本，并按照随附的文字方案所述方法制备血管。将插管的动脉加压至5 mmHg。

然后通过启动双光子激光器并将激发波长设置为820纳米，建立成像的光路。插入一个460纳米长通二向色镜，将发射光在光电倍增管之间分光，并在两个通道中同时收集发射信号。使用中心波长为520纳米、带宽为30至60纳米的带通滤光片收集弹性蛋白的自发荧光，另使用中心波长为410纳米的带通滤光片收集胶原蛋白的二次谐波生成信号。

现在将激光驻留时间及像素设为10微秒。将分辨率为512 × 512像素，对应100%视野。启用连续扫描，并尽可能使用最低的激发光功率和像素驻留时间，以避免对活体动脉造成光损伤。

然后手动扫描动脉，找到直径最大的平面。接着，选择一个矩形切片，覆盖动脉最宽处的直径，并以每像素300纳米或更小的像素尺寸扫描单帧图像。将此图像保存，以供后续分析使用。

为了测定动脉最大直径处的管腔直径和管壁厚度，首先在 Fiji 中加载图像。通过点击主菜单，然后依次选择分析（Analyze）和设置尺度（Set Scale）来设定比例尺。在此处输入微米/像素和像素比例。

接下来，选择 Fiji 的线工具，在动脉管腔两侧的两条内弹性膜之间画一条线。然后按 Ctrl+M，将长度记录在结果表中。继续绘制更多线条以测量每层管壁的厚度，并保存最终测量结果。

更换为数值孔径为1或更高的60倍物镜。在5毫米汞柱压力下，扫描动脉壁的完整厚度，以成像胶原蛋白和弹性蛋白的微结构。接下来，定义Z轴堆栈的起始与终止深度、Z轴步进间距以及像素密度。

设计Z轴层扫时，确保目标区域足够小，以避免在后续分析中引入曲率干扰。完成后，设置各通道分别保存。最后，选取一至三个不同的目标区域，获取高质量的三维图像层扫数据。

如果您的弹性蛋白自发荧光正在发生漂白，则说明激发光功率过高，应避免这种情况。为了完成正在进行的实验，可添加低浓度的伊红以增强弹性蛋白的自发荧光。

完成之后，在压力最高达100毫米汞柱的范围内重复整个过程，每次压力变化后均需用新鲜的37摄氏度HBS缓冲液替换肌动描记器腔室中的缓冲液。开始图像分析时，在Fiji中打开弹性蛋白图像堆栈，然后转到图像，点击堆栈，选择Z投影以选定要处理的图像，并选择最大强度投影作为投影类型。

将最大强度投影保存为 TIFF 图像。然后尽可能多地选择内弹性膜纤维分支点，并使用角度工具进行测量。系统地处理每张图像，完成后保存 Fiji 结果表格。

为了测量外膜胶原的波浪状结构，首先在 Fiji 中打开胶原图像堆栈。接着，点击图像菜单下的堆栈选项，选择 Z 投影以选定需要处理的图像并设置最大强度投影。随后，通过点击图像、类型，然后选择 8 位，将图像类型更改为 8 位 TIFF 图像。

将最大强度投影保存为 TIFF 图像。单击 Fiji，然后在插件中选择 Neuron J，以打开 Neuron J 插件。随后在 Neuron J 中打开8位 TIFF 文件。文件打开后，单击“添加轨迹”，通过单击每根纤维的起点和终点来选择要分析的纤维。

接下来，进入测量轨迹，选择对话框中的显示轨迹和顶点测量。为计算胶原纤维的直线度，首先将 Fiji 轨迹窗口中的数值复制到 Excel 中。轨迹窗口中的长度值表示所分析胶原纤维的全长 Lf。其次，将所分析的每条胶原纤维束在 Fiji 顶点窗口中的第一个和最后一个 XY 坐标复制到 Excel 中。

然后使用勾股定理计算所分析胶原纤维两端之间连接的直线长度 L0。最终通过 L0/Lf 计算胶原纤维的直度。按照上述所示方案，确定动脉最宽的部分，并在该位置利用无标记荧光显微镜扫描动脉，以测量最大血管直径和血管壁厚度。

使用更高放大倍数和高数值孔径的物镜，不仅可以测量血管直径和管壁厚度，还能分析胶原蛋白和弹性蛋白的微细结构。利用适当图像分析软件，可在连续的图像切片中确定弹性纤维分支角度和胶原蛋白直线度等微细结构特征。这使得能够直接分析不同压力下胶原蛋白和弹性蛋白微细结构变化与增量弹性模量之间关系。

通过该方法，还可以从图像中提取其他信息，例如血管外膜胶原沿血管纵轴的取向角度，或中膜细胞外基质的微结构。利用此方法从图像中提取的定量数据可输入数学模型，以阐明健康与病变的人体循环系统在不同条件下的响应机制。

观看本视频后，您应能够全面了解如何设计成像实验及后续的图像分析，以获取有关压力如何诱导阻力动脉壁微结构变化的信息。请务必注意，在使用双光子激发荧光显微镜时，必须避免样品暴露于可见光和不可见光下。