研究局部胶原结构与动脉粥样硬化斑块纤维组织力学特性相关性的方法

该方案可实现对纤维斑块组织中胶原结构及力学失效特性的局部评估。由于结构与力学评估均在同一组织样本上进行，该技术有助于揭示组织结构特性与力学特性之间的功能关联。通过本方案获得的关于纤维斑块组织结构与失效特性的知识，对于预防和预测由动脉粥样硬化斑块破裂引发的临床致命事件至关重要。

首先，使用手术剪刀和镊子沿动脉的长轴方向将斑块切开。从斑块标本中切割出矩形测试样品，确保样品尽可能大，同时避开含有撕裂或钙化区域的组织。接下来，取一块斑块测试样品，通过将针插入组织，将其两端固定在硅胶上。

将针插入样品中将在机械测试期间被拉伸测试设备夹具夹住的区域。戴上护目镜。使用侧切钳将针剪短，使其在样品表面以上突出部分小于几毫米，以防止其损坏显微镜物镜。

用 PBS 填充培养皿，直至样品完全浸没。接着，打开显微镜系统，开启多光子激光开关，并启动显微镜的操作软件。将含有待测样品的培养皿置于物镜下方，并降低显微镜物镜。

打开实时扫描模式。使用智能面板上的旋钮将物镜移至样品的一个角落，然后点击Tile Scan面板中的标记位置符号。如果操作正确，用于成像的所有选定区域将显示为橙色网格。

接下来，点击屏幕右下角的“开始”按钮，对整个样品表面创建图块扫描，以获得样品形貌的概览。完成图块扫描后，在自动显示的“图块扫描”面板中观察左上角图块的左上角对应的 X 和 Y 坐标。将这些坐标记录在电子表格中。

在“Tile Scan”面板中，观察名为“ScanField”的框内X和Y方向上的图块数量。在电子表格中记录图块扫描的尺寸。通过加上或减去图块的尺寸，计算其他图块的坐标。

从平铺扫描中选择将使用二次谐波生成（SHG）成像的区域。在选择时，应避开夹具所在区域，并在所选区域之间沿纵向和周向均间隔一个区域。接下来，利用此电子表格中计算出的坐标，确定待成像区域的位置。

在指定的输入框中填写坐标，然后点击“Enter”，使物镜移动到正确的区域。开启实时扫描模式。通过使用上方面板中的滑块和光路设置，增加多光子（MP）激光功率，以获得尽可能高的激光功率，同时避免明显的漂白现象。

然后，通过智能面板上的旋钮或点击探测器名称、光束路径设置及附加通道，调节探测器增益，以获得无饱和像素的明亮图像。探测器增益的典型值介于500至800伏之间。使用智能面板上的Z轴位置旋钮调节焦平面。

然后，移动到样品的顶部，通过点击采集选项卡下第三个面板中Z-stack面板内的箭头来设定Z-stack顶部的位置。接着，聚焦样品，直到无法检测到SHG信号为止。再次点击Z-stack面板中的箭头，以设定此位置。

完成后，关闭实时扫描模式。在第二个面板的“采集”选项卡下，将扫描速度保持在 400 赫兹，使用下拉列表将线平均值设置为 2，分辨率为每幅图像 512 × 512 像素。启用双向 X 轴扫描按钮。

在Z-stack面板中点击z步进大小，然后在框中输入3微米的z步进大小。点击屏幕右下角的“开始”以创建Z-stack。完成后，将该图像块的坐标保存在文件名中，或为每个图像块编号。

成像后，将样本进行力学测试。为生成斑驳图案，手持装有组织染料的喷笔，距离测试样本约30厘米，将染料喷涂于样本的管腔表面。接着，进行单轴拉伸测试时，将样本置于拉伸试验机的夹具中，使样本的周向与拉伸方向对齐，并使样本的管腔面朝上。

确保设定初始标距，使条状试样的宽长比小于1。使用扭矩螺丝刀施加20厘牛·米的扭矩，拧紧夹具的螺丝。向加热浴槽中加入磷酸盐缓冲液（PBS），直至样品完全浸没。

撕裂负荷传感器，并开始记录来自拉伸试验机的负荷传感器和执行器的全局力和位移测量值。施加0.05牛顿的预拉伸以消除试样中的松弛，使试样伸直。在施加预拉伸后，根据执行器测得的标距长度，进行10次预循环，最大应变至10%。

启动单轴拉伸试验，直至样品完全断裂，同时使用高速相机记录样品变形过程的视频。断裂后，停止记录整体的力和位移测量数据。在 Image J 中打开多光子显微镜（MPM）结合二次谐波成像（SHG）获得的 Z 层扫描图像，并对每个 Z 层扫描图像生成最大强度投影（MIP）。

使用基于开源 MATLAB 的纤维取向分析工具分析每张最大强度投影图像（MIP），以测量图块中单个胶原纤维的取向角度。使用另一个基于 MATLAB 的工具 FibLab，对角度分布直方图拟合高斯分布。从高斯分布图中提取结构参数，例如分布的众数即主要纤维取向角、纤维角度分布的标准差以及各向异性分数。

通过目视检查相机图像，确定裂纹起始发生的帧，并目视识别裂纹位置。使用基于MATLAB的软件ncorr，结合拉伸试验期间记录的相机图像，进行数字图像相关（DIC）分析。

选择在最终拉伸至断裂前的最后一帧作为参考图像。对于当前图像，选择从最终拉伸开始直至裂纹萌生前一帧之间的所有图像。将样品表面选为感兴趣区域（ROI）。

排除靠近夹具的区域。进行数字图像相关（DIC）分析时，将参数的子集半径设为30像素，子集间距设为3像素，迭代截止值设为50，差分向量范数截止值设为10的5次方，应变半径设为5，自动传播步长设为5。通过ncorr的DIC分析，获得感兴趣区域（ROI）的格林-拉格朗日或欧拉应变分布。

利用这些应变分布，计算破裂前最后一帧整个斑块样本表面的平均格林-拉格朗日应变。计算破裂位置处的格林-拉格朗日应变。通过测试样本中的天然标记点，将参考图像与图块扫描图像叠加，以在图块扫描图像上确定破裂位置。

确定发生断裂的 MPM-SHG 图像区域。如果断裂未发生在 MPM-SHG 扫描的区域内，则确定距离断裂位置最近的图像区域。获取断裂发生区域的结构参数。

此处显示一个新鲜且完整的斑块样本，几乎没有撕裂和大块钙化。斑块样本可取自不含此类撕裂和钙化的区域。二次谐波成像（SHG）及图像后期处理可提供每个成像区域的投影最大强度图像（MIP）。

通过纤维检测进行进一步的后处理，可得到纤维取向直方图，并从中提取胶原结构参数。此外，还可获得显示整个斑块样本中局部胶原结构参数分布的彩色图谱，用于可视化分析。在这些测试样本中，观察到胶原结构参数存在较大的样本内变异。

此处展示了在拉伸试验中斑块组织样本的破裂起始与扩展过程。数字图像相关分析提供了局部组织变形图，例如格林-拉格朗日应变图。根据这些应变图，观察到样本内部局部应变存在显著差异。

一旦在摄像记录中确定了破裂位置，便可将其映射回参考相机图像和显微镜图块扫描图像中。这能够确定发生破裂的多光子显微-二次谐波成像图块，以及该图块处的结构参数。对于严重钙化的斑块而言，获取无钙化且尺寸足够大、可用于力学测试的纤维组织样本可能是一项具有挑战性的任务。

一旦确定某种力学或结构特征可作为纤维斑块组织破裂的预测指标，能够测量该特征的体内成像系统将有助于预测患者斑块破裂的风险。