探索根系微生物组：从土壤、根际和根内圈提取细菌群落数据

本实验的总体目标是通过16S核糖体RNA基因的群落谱型分析，对根系微生物组的三个区室——土壤、根际和根内圈——进行表征。该方法有助于回答微生物生态学中的关键问题，例如影响微生物组结构的重要生物和非生物因素。该技术的主要优势在于，它对从根与根际的分离、DNA提取到测序文库制备的每一步都实现了标准化。

本次实验操作由Coleman-Derr实验室的研究生Tuesday Simmons示范。开始实验前，使用经乙醇灭菌的土壤钻取器采集无植物根系的土壤样品。从植物基部向外约23至30厘米处采集土芯。

接下来，将土壤转移至一个塑料袋中，通过轻轻摇晃袋子使土壤均质化，取600毫克土壤样品放入一个2毫升离心管中，并立即将该2毫升离心管置于干冰上，直至进行DNA提取。为采集根系及根际土壤，使用经乙醇灭菌的铲子将植株挖出，注意尽可能完整地获取根系。轻轻摇动根部以去除多余土壤，直至根系表面附着约2毫米厚的土壤层。

对于大型植物，使用无菌剪刀剪取具有代表性的根部小段，并将至少500毫克的根组织放入一个50毫升的锥形管中。加入足量的表生微生物去除缓冲液以浸没根部，然后立即将样品置于干冰上。为了将根际与根部分离，先将根样品在冰上解冻，然后对根样品进行超声处理。

使用无菌镊子将根转移至预冷的洁净50毫升离心管中。请勿丢弃含有缓冲液和土壤的原始离心管，其中含有根际圈组分。

接下来，离心含有缓冲液和根际样品的离心管。倾去上清液，将根际组分置于干冰中。用约 20 毫升 4°C 的无菌水冲洗根部组分。

用力振荡清洗根部15至30秒，然后倒掉水。使用无菌刮勺迅速将250毫克土壤和根际样品分别转移至土壤DNA提取商品试剂盒提供的收集管中，随后按照试剂盒供应商提供的操作步骤进行处理。洗脱后，将DNA于-20°C保存，直至准备进行扩增子文库构建，然后提取根样品中的DNA。

使用液氮冷却已灭菌的研钵和研杵。称取 600 至 700 毫克根组织，将组织放入研钵中，并小心加入足量液氮以完全覆盖根组织。将根组织研磨成小碎片。

重复添加液氮并研磨至少两次，各样本间操作需保持一致，直至根组织成为细粉。在根粉开始解冻前迅速操作，使用无菌刮勺将根粉转移至预称重的、置于冰上的1.5毫升离心管中。记录管和粉末的总重量。

使用无菌刮勺迅速将 150 毫克根粉转移至专为土壤样品 DNA 提取设计的商品化 DNA 提取试剂盒所提供的收集管中，随后按照试剂盒供应商提供的方案进行 DNA 提取。配制足量的 PCR 扩增主混合液，以对每个 DNA 样品进行三复孔扩增。将主混合液倒入无菌的 25 毫升多通道移液器储液槽中，并向新的 96 孔 PCR 板的每孔分配 66 微升主混合液。

接下来，从标准化的DNA板中取六微升浓度为每微升五纳克的DNA，加入到主混合板中。然后，向主混合板中加入1.5微升浓度为10微摩尔的正向引物，使每一列含有不同的正向条形码，并加入1.5微升浓度为10微摩尔的反向引物，使每一行含有不同的反向条形码。用封口膜覆盖板孔，于3,000 RCF短暂离心。

使用多通道移液器轻轻混匀反应液，然后将混合物分装至三个孔板中，每孔加入25微升反应体系，并用PCR封板膜覆盖孔板。使用PCR仪扩增各孔板中的DNA。扩增完成后，将三个重复孔板的反应产物合并至一个96孔板中。

使用计算机电子表格，计算每个样本中 100 纳克对应的体积，以及所有样本的平均体积。针对每个空白的 PCR 产物，将计算所得的平均体积加入同一个 1.5 毫升离心管中。对于成功扩增的样本，将每个样本的 100 纳克等量混合至同一离心管中，然后使用台式荧光计测量混合产物的浓度，并将 600 纳克 DNA 溶解于分子生物学级水中，最终体积为 100 微升，置于 1.5 毫升离心管中。

将剩余的混合产物于-20摄氏度保存。在纯化600纳克DNA等分试样之前，配制600微升新鲜的70%乙醇。使用磁性珠按照既定的PCR纯化流程进行操作。

轻轻振荡磁珠管，使沉降到管底的磁珠重新悬浮。向含有600纳克DNA的等分试样中加入1倍体积（即100微升）的磁珠溶液。通过移液器吹打混合溶液和磁珠10次，确保充分混匀。

充分混匀后，将混合物在室温下孵育五分钟。将离心管置于磁力架上两分钟，或直至溶液变澄清，以分离磁珠与溶液。保持离心管在磁力架上，小心吸取上清液，避免接触磁珠，并弃去上清液。

将离心管置于管架上，向管中加入 300 微升 70% 乙醇，在室温下孵育磁珠 30 秒。用移液器吸去乙醇并弃去。重复此步骤，并在第二次洗涤后彻底去除所有乙醇。

将离心管从磁力架上取下，在室温下晾干管内物质5分钟。向干燥的磁珠中加入30 µL分子生物学级水，用移液器吹打10次混匀。室温孵育2分钟。

将离心管放回磁力架上静置1分钟，使磁珠与溶液分离。将上清液转移至新的离心管中。使用台式荧光计测定纯化后合并DNA的最终浓度。

将等分试样稀释至终体积为30微升、终浓度为10纳摩尔，或根据测序机构的要求调整至其偏好的浓度和体积。扩增步骤完成后，进行测序以确定每个样品中细菌群落的组成。所用PNA序列与所研究植物宿主的叶绿体和线粒体16S核糖体RNA基因序列比对时，不应出现任何错配。

与13个碱基对的PNA序列存在单个错配即可显著降低其有效性，例如所提供的PNA序列与莴苣（Lactuca sativa）叶绿体16S核糖体RNA基因之间的匹配情况。由于每个样本混合了等量的扩增DNA，测序后根据其条形码索引进行分类，每个样本获得的匹配细菌分类群的读长数量均大致相等。一旦掌握该技术，可在约八小时内完成八个植物样本的实验。

在进行该实验流程时，保持各次实验之间的一致性至关重要。诸如DNA提取方法和PCR预混液的细微变化等细节均可能引入偏差。在完成本流程后，可采用其他方法（如宏转录组学）进一步回答更多问题，例如哪些微生物具有活性，以及它们正在表达哪些基因？

请注意，使用液氮可能具有极高的危险性，进行此操作时必须采取预防措施，例如穿戴适当的个人防护装备（PPE）。