小鼠耐受性树突状细胞的开发与功能表征

本实验方案的总体目标是开发并表征小鼠耐受性树突状细胞，以评估其在治疗多发性硬化等自身免疫性疾病中的免疫治疗潜力。该方法通过提供一种标准化的耐受性树突状细胞培养与功能表征方法，有助于解答耐受性树突状细胞治疗领域中的关键科学问题。该技术的主要优势在于，可用于成功诱导耐受性树突状细胞的生成，并进行其功能有效性检测。

该技术的意义重大，可进一步推动针对自身免疫性疾病的细胞免疫治疗的发展，因为耐受性树突状细胞能够在保持自身固有免疫调节机制的前提下，重置异常的免疫反应。根据标准操作流程，取8至10周龄的C57BL/6小鼠的后肢骨骼，使用手术刀片和镊子尽可能剥离全部组织，将清洁的胫骨和股骨置于含有70%乙醇的6厘米培养皿中。

使用手术刀修剪骨骼的两端，并用配备23号针头的3毫升注射器，将3毫升PBS冲洗液注入第一根骨骼中，以冲出骨髓至15毫升锥形管中。当所有骨髓均收集完毕后，离心细胞悬液，并将沉淀物重悬于1毫升红细胞裂解缓冲液中。5分钟后，加入9毫升PBS终止裂解反应，再通过离心收集细胞。

将白色骨髓细胞沉淀重悬于10毫升培养基中，通过40微米细胞筛网过滤至新离心管中。用添加了GM-CSF和IL-4的培养基将细胞调整至浓度为1×10⁶个细胞/毫升。每孔加入3毫升细胞悬液至6孔板中，于37°C、5% CO₂条件下培养3天。

第三天，用两毫升 PBS 轻柔振荡洗涤每个孔中的细胞，以去除未贴壁的细胞。随后，向每个孔中加入三毫升新鲜培养基（补充 GM-CSF 和 IL-4），并将细胞放回细胞培养箱中。两天后，向每个孔中再添加三毫升新鲜培养基（补充细胞因子）。培养第七天，将培养板置于冰上。

孵育10分钟后，轻轻吹打每孔中的培养基，使松散贴壁的、未成熟的骨髓来源树突状细胞悬浮。随后，收集细胞悬液，离心后弃上清，并将细胞沉淀重悬于适当体积的新鲜培养基中，用于后续分析。为检测同基因型T细胞的增殖，首先取8至10周龄的OT2 C57BL/6小鼠脾脏，用3毫升注射器活塞尾端将其研磨通过40微米细胞筛网，并用PBS冲洗筛网。

通过离心收集混合的细胞悬液，将沉淀重悬于400 µL磁性细胞分选缓冲液和100 µL CD4阳性T细胞生物素标记抗体混合液中，于4°C孵育5分钟。孵育结束后，向细胞中加入300 µL分选缓冲液和200 µL抗生物素磁珠，于4°C继续孵育10分钟，并将磁珠分选柱和预分离滤器放入合适尺寸的细胞分离磁铁中。用3 mL分选缓冲液冲洗分选柱，然后向细胞中加入9 mL分选缓冲液。

离心后，用三毫升分选缓冲液重悬细胞和磁珠沉淀，并将细胞悬液加入柱中，以适当容器收集 CD4 阳性 T 细胞穿流液。随后用另三毫升分选缓冲液洗涤柱子，收集流穿液，并将 T 细胞置于冰上。对于同源性脾脏总树突状细胞的分离，取一只 8 至 10 周龄的 C57BL/6 小鼠的脾脏，置于一个六厘米培养皿中，使用配备 25 号针头的 1 毫升注射器，将一毫升胶原酶 D 溶液向脾脏内注射两次。

接下来，使用剪刀将脾脏剪成小块，并在室温下振荡孵育25分钟。孵育结束后，向组织悬液中加入500微升0.5摩尔的EDTA，室温下再孵育5分钟。孵育结束后，用3毫升注射器活塞的末端将脾脏悬液碾压通过40微米细胞筛网，并通过离心收集细胞。

将沉淀重悬于350微升磁性细胞分选缓冲液、50微升Fc受体阻断试剂和100微升泛树突状细胞生物素标记抗体混合液中，在4摄氏度孵育10分钟。孵育结束后，用9毫升分选缓冲液洗涤细胞，并将沉淀重悬于800微升新鲜分选缓冲液中，加入200微升抗生物素磁珠，在4摄氏度孵育10分钟，以通过磁珠分选法分离脾脏泛树突状细胞群体，方法如前所述。将细胞重悬至浓度为每毫升2×10⁵个树突状细胞，并在37摄氏度下用适当实验浓度的目标三萜化合物处理1小时。

在孵育的最后三分之一阶段，将T细胞以每毫升1×10⁷个细胞的浓度重悬于1微摩尔CFSE中，在37摄氏度下孵育15分钟。随后用PBS洗涤细胞，并调整体积至最终浓度为每毫升2×10⁶个T细胞。在96孔板的每个孔中，将100微升经处理的树突状细胞与100微升CFSE标记的CD4阳性T细胞共培养，并向其中加入每毫升100纳克的OVA肽323-329，孵育2至3天后通过流式细胞术检测T细胞的CFSE荧光强度。

在完全培养基中培养骨髓祖细胞，并在存在GM-CSF和IL-4的条件下培养六天后，细胞呈现未成熟树突状细胞的形态。对培养第七天的骨髓来源树突状细胞进行分析，结果显示大多数培养细胞强烈表达CD11c，这是一种特异性的鼠源树突状细胞标志物。尽管CDDO-DFPA处理对LPS诱导的成熟标志物表达无明显影响，但骨髓来源树突状细胞在CDDO-DFPA处理下表现出耐受性树突状细胞的特征，表现为促炎基因表达显著降低，且即使在LPS刺激后，抗炎细胞因子基因表达仍增强。

此外，在体外共培养实验中，当卵清蛋白（OVA）由经 CDDO-DFPA 处理的树突状细胞呈递时，可观察到同基因型 OVA 特异性 T 细胞增殖显著减少；在体内实验中，注射经 MOG 脉冲并用 CDDO-DFPA 处理的树突状细胞后，实验性自身免疫性脑脊髓炎的进展延迟，进一步证实了这些细胞的耐受性表型。一旦掌握该技术，若实验操作得当，可在八天内获得耐受性树突状细胞。在进行该操作时，需注意耐受性树突状细胞并非均一的细胞群体。

其细胞表型取决于用于诱导其耐受性的试剂的性质。通过此操作步骤，还可进行其他方法，例如详细的流式细胞术分析，以进一步探究耐受性树突状细胞所诱导的抗原特异性T细胞无能或凋亡情况，以及T细胞分化能力等问题。观看本视频后，您应能够充分理解如何利用已知试剂制备具有功能活性的耐受性树突状细胞，或如何检测新物质诱导此类细胞的能力。