免疫刺激剂评估：淋巴组织提取及依赖注射途径的树突状细胞激活

本实验的总体目标是熟悉从小鼠中分离纵隔淋巴结所需的独特技术。该手术操作是在小鼠体内通过六种不同途径注射免疫刺激物后进行的。在本研究中，我们使用了一类能够形成纳米级结构的新型材料。

表面活性剂由亲水性头部基团和疏水性尾部组成。由于微相分离，这些分子会形成球形胶束或其他二级结构。我们利用这一特性来作用于DNA这种生物大分子。

DNA 两亲分子如图所示，与常规核苷酸 A、C、G、T 一样具有亲水区段，而脂质修饰的神经细胞碱基则作为疏水单元。该修饰寡核苷酸通过 DNA 合成仪大规模合成了八聚体。在等介质中，这些两亲性脂质 DNA 可自发形成纳米级球形胶束。

当胶束形成时，DNA 保持单链状态，作为直径约10纳米的空载体存在。为了使载体具备免疫刺激功能，只需将DNA序列延伸，加入以eCpG命名的Toll样受体9佐剂即可。因此，脂质DNA与eCpG在此结合，使得胶束的外表面带有CpG序列。

随后我们将这种免疫刺激性纳米颗粒命名为INP。为了确定INP引发免疫反应的最佳方式，我们通过64种不同的注射途径将INP注射到小鼠体内，并对相应的淋巴结组织进行了分析。有关更详细的注射操作说明，请参考Charles River于2012年发表的一篇JOB文章。

本视频的主要优势在于直观展示如何获取纵隔淋巴结。视频明确标出了纵隔淋巴结的位置，而许多人在分离器官时对此感到困难。所有实验均按照上海公共卫生临床中心或首尔大学医学院机构动物护理和使用委员会的指南进行。

本部分将展示用于免疫学分析的关键器官或组织的具体位置。将分离脾脏和两个淋巴结。首先，根据机构动物护理和使用委员会的指导原则，通过吸入二氧化碳的方式对小鼠实施安乐死，并尽一切努力将动物痛苦降至最低。

从现在开始，让我们找到器官并将其分离。首先，用四枚大头针将小鼠的掌部固定在手术台上，确保小鼠被妥善固定。用酒精对解剖区域进行消毒。

使用大号剪刀解剖小鼠腹部底端的外层组织。用镊子打开两侧附着处，并用大头针固定在手术台上。通过寻找通向左后肢的血管交汇处，暴露腹股沟淋巴结的位置。

容器的形状类似于倾斜的字母 Y。用镊子揭开该层组织，并从皮肤上将其拉开。使用较小的剪刀剪开腹膜，以暴露内部器官。用镊子将肠道移向右侧，然后在腹腔左上方可见的脾脏周围进行包裹。

由于脾脏容易破损，操作过程中需格外小心。最后是本视频的关键步骤：获取纵隔淋巴结。该淋巴结位于肺上部的下方，因其体积较小且位置较隐蔽，较难观察。

使用小剪刀和镊子小心地暴露该区域。同时剪开肋骨两侧和膈肌。用夹子夹住胸腔上方剪下的肋骨断端。

操作过程中应避免损伤心脏和血管，以免血液遮蔽视野，影响寻找透明的纵隔淋巴结。若不慎导致血管破裂，应用纱布轻轻擦拭清除血液。抓住肺的左侧，轻柔地将其翻转至另一侧，以观察肺下方区域。

使用镊子提起纵隔淋巴结。在收获纵隔淋巴结后，务必彻底去除淋巴结周围的所有脂肪和血液，因为不需要的组织可能会影响分析结果。最后，将所有分离的器官置于盛有培养基的培养皿中。

在此流式细胞仪上分析了总计 0.1 × 10⁶ 个细胞。根据前向散射光和侧向散射光信号对白细胞群体设门，并通过阴性染色排除非特异性细胞。在通过 64 种注射途径进行 INP 注射后 24 小时，收集脾脏、腹股沟淋巴结和纵隔淋巴结，并通过流式细胞术分析树突状细胞（DC）的活化情况。

根据流式细胞术策略，DC群体被定义为活体白细胞中CD11C阳性且谱系标记阴性的细胞。值得注意的是，与PBS对照组相比，鼻内注射INP显著促进了纵隔淋巴结中CD40、80和86的表达。因此，这些数据表明，鼻内注射INP可作为黏膜佐剂，用于增强肺部免疫反应。