一种简单且可重复的制备新鲜分离大鼠脑微血管膜样本的方法

本实验的总体目标是从大鼠脑组织中分离脑微血管，用于生化研究，以阐明哺乳动物血脑屏障的分子特征。该方法有助于回答血脑屏障生理学和神经药理学领域的关键问题，例如在健康与疾病状态下紧密连接蛋白及内源性转运蛋白的调控、定位和表达情况。该技术的主要优势在于，我们能够从单个动物体内分离出足够数量且高质量的微血管，同时充分考虑个体动物间蛋白质表达的自然变异性。

本技术将由我实验室的优秀本科生Bianca Reilly进行演示。根据文本方案，处死并斩下Sprague-Dawley大鼠的头后，使用手术剪进行一次横向切割，切除颅骨上的皮肤。使用咬骨钳小心移除颅骨骨板，暴露大脑。

然后，用刮勺取出器官，分离大脑，并将分离出的脑组织放入含有 5 毫升 BMB 和 5.0 微升蛋白酶抑制剂混合液的 50 毫升锥形管中。为处理组织，将其转移至洁净的培养皿中。

然后，用镊子将脑组织在直径为12.5厘米的滤纸上轻轻滚动，以去除紧贴大脑皮层的外层脑膜，这些脑膜与大脑皮层松散附着。在此步骤中，应注意确保已将所有脑膜组织从脑组织样本上去除。脑膜可被观察为一层透明的膜状组织，可轻易从脑组织上剥离。

轻轻将脑组织按压在滤纸上，并再次滚动组织，此过程中需频繁转动滤纸。然后，使用镊子将脉络丛从大脑半球分离。接着，再次轻柔地压平脑组织，并用镊子去除邻近白质的嗅球。

将皮层脑组织放入预冷的玻璃研钵中。然后加入5毫升含有蛋白酶抑制剂混合物的BMB缓冲液。使用电动匀浆器，将研杵插入研钵中，在3,700 rpm条件下上下匀浆15次。

然后，将匀浆液倒入已标记的离心管中。在处理不同样本之间，使用70%乙醇清洗研杵。进行离心时，向每支含有脑匀浆液的标记离心管中加入8.0毫升26%的葡聚糖溶液。

将试管倒置两次，然后充分涡旋混匀样品。对每个样品采用多个角度进行涡旋，以确保脑匀浆液与26%蔗糖溶液充分混合。在4°C条件下以5,000 g离心15分钟。

吸去上清液，将沉淀重悬于 5.0 毫升含有蛋白酶抑制剂混合物的 BMB 中。然后涡旋振荡沉淀，以确保充分混匀。接下来，向每根离心管中加入 8.0 毫升 26% 葡聚糖，并按前述方法进行涡旋振荡。

然后再次离心样品。使用真空抽滤瓶和玻璃移液管吸除上清液，注意不要破坏含有脑微血管的沉淀。将沉淀物用含蛋白酶抑制剂的 BMB 重悬，再用 26% 葡聚糖重复处理两次。

最后一次离心后，向每份沉淀中加入 5.0 毫升 BMB，并涡旋振荡以重悬样品。采用本视频中演示的方案，成功地从大鼠脑组织中分离出完整的微血管。在本图中，微血管使用针对 Oatp1a4 的抗体进行染色，该转运蛋白在脑微血管内皮细胞的质膜上高表达。

如 Western 印迹所示，从雌性 Sprague-Dawley 大鼠分离的微血管膜组分中富含 PECAM-1（也称为 CD31），这是脑微血管的标志蛋白。在本方案优化过程中，使用两步和四步葡聚糖离心法所制备的膜样品中均观察到 PECAM 的富集。根据 Bradford 蛋白质测定法测定的结果并如本表所列，膜组分的蛋白浓度通常介于 5.0 毫克/毫升至 10.0 毫克/毫升之间。

蛋白浓度根据以 BSA 作为标准品绘制的标准曲线确定。此处显示的是血脑屏障转运蛋白 Glut1 的蛋白质印迹结果。在每份膜样品中，该高表达的血脑屏障蛋白均在 54 千道尔顿处检测到清晰的单一条带。

该图显示，在雄性大鼠与雌性大鼠相比，血脑屏障处 Glut1 的表达水平更高。雄性和雌性动物之间钠/钾 ATP 酶的表达未观察到差异。一旦掌握该技术，若操作得当，可在 2 至 2.5 小时内完成。

在进行该实验操作时，需始终注意将所有样品置于冰上，并在离心步骤后吸取微血管沉淀物上清液时小心操作。完成该步骤后，可对微血管样品进行其他方法分析，例如共免疫沉淀分析，以回答更多科学问题，如血脑屏障中同一蛋白质复合物内不同蛋白质之间的相互作用关系。该技术建立后，为血脑屏障生理学及神经药理学领域的研究人员探索健康状态下以及神经疾病啮齿类动物模型中血脑屏障的分子特征开辟了道路。

观看本视频后，您应能充分掌握如何从大鼠脑组织中分离高质量的微血管，以便开展您自身关于健康与疾病状态下血脑屏障生物学的研究。