跨五个脊椎动物类群的中枢神经系统微血管可靠分离

本方案具有重要意义，因为它能够实现不同中枢神经系统区域之间以及不同个体之间的微血管结构的比较。该微血管分离技术可在一天内完成，且无需超速离心和酶解离步骤。然而，去除软脑膜和脉络丛可能较为困难。

务必缓慢而仔细地操作，以确保完全去除每一块组织。对于小型无脑回脊椎动物标本的中枢神经系统组织解剖，将获取的脑组织放入含有 MV-1 溶液、置于冰上的 15 毫升锥形管中，并用镊子从颅骨的蝶鞍部取出垂体。将垂体置于装有 MV-1 溶液、置于冰上的 1.7 毫升微量离心管中，然后去除皮肤和肌肉以暴露脊柱。

去除四肢、肋骨和内脏器官后，使用装有18号针头的10毫升注射器，将新鲜的MV-1溶液从腰椎椎管的尾端向头端方向冲洗脊柱。然后将脊髓放入含有新鲜MV-1溶液的5毫升离心管中。接着，在解剖显微镜下将脑组织置于培养皿中，并用双尖针去除脑膜。

务必检查脊髓，确保无残留的脑膜组织。使用镊子分离下丘脑、小脑、脑干和大脑皮层。必要时，使用镊子以及虹膜剪和弹簧剪切除嗅球和丘脑，并使用双尖探针清除所有脑室中的脉络丛。

对于大型沟回型脊椎动物标本的中枢神经系统组织解剖，使用解剖显微镜以及双齿探针、镊子、虹膜剪和弹簧剪，小心去除各中枢神经系统组织上的脑膜，并注意清除脑室内的脉络丛组织。为均质化所获取的中枢神经系统组织，需在各自的培养皿中将每个中枢神经系统区域切成一至二毫米大小的组织块。对于小型脊椎动物标本的中枢神经系统组织均质化，使用移液管加入一毫升 MV-1 溶液以悬浮切碎的组织。

然后使用同一支移液管将大脑皮层、小脑、脑干、视叶和脊髓组织分别加入到各自的10毫升玻璃组织研磨器中，每个研磨器中加入5毫升MV-1溶液，并使用聚四氟乙烯（PTFE）研杵对每份组织进行约10次研磨。将每份组织匀浆分别转移至预置于冰上的15毫升锥形管中，并用镊子将下丘脑和垂体分别放入含有100微升MV-1溶液的1.7毫升离心管中。随后，使用玻璃微型研杵小心地对每份组织进行匀浆处理。

为均质化大型脊椎动物样本，使用斜口移液管将切碎的组织转移至55毫升玻璃组织研磨器中，并将研磨器连接至顶置式搅拌器。根据表格中指定的特定中枢神经系统部位，加入推荐体积一半的MV-1溶液，然后启动顶置式搅拌器，转速调至约每分钟150转。关闭搅拌器前，小心上下移动玻璃管约30秒，随后加入更多MV-1溶液进行进一步均质化，直至获得均匀的悬液。

然后将匀浆后的组织转移至预冷的50毫升锥形管中，置于冰上。进行微血管纯化时，通过离心沉淀中枢神经系统组织匀浆物，并弃去上清液。对于小型脊椎动物样本的微血管分离，每份样品加入5毫升新鲜的冰冻MV-2溶液，用移液器将大脑皮层、小脑、脑干、视叶和脊髓的沉淀物反复吹打约10次，随后再向每根试管中各加入5毫升冰冻的MV-2溶液。

轻轻翻转试管以混匀，并在1毫升MV-2溶液中重新悬浮下丘脑和垂体沉淀。对于大型脊椎动物标本的微血管分离，向皮层、小脑、脑干和脊髓的微血管沉淀中加入20毫升冰冻的MV-2溶液，并在40转/分钟的试管旋转仪中重新悬浮约5分钟。重悬结束后，通过离心分离中枢神经系统组织裂解物，缓慢旋转每支试管，使上清液沿管壁流动，以小心地将液体界面处厚而致密的髓鞘层从管壁上分离下来。

弃去髓鞘和液体界面，用包裹无尘纸的刮刀擦拭每根试管内壁。然后，用拧成螺旋状的无尘纸吸除多余液体，使用低吸附枪头将每个沉淀物重悬于1 mL MV-3溶液中。进行微血管洗脱和过滤时，向每份中枢神经系统组织微血管悬液中加入数毫升新鲜MV-3溶液，边混合边避免形成团块，随后将每份悬液通过Pruitt滤器过滤至各自的50 mL锥形管中。

每个中枢神经系统区域使用一个改良的滤器支架，并在其上放置一个20微米的尼龙网滤器。将滤器支架转移至一个50毫升的锥形管中，用5毫升冰冻的MV-3溶液润湿滤器，确保缓冲液沿滤器支架流下并进入锥形管。将洗脱出的微血管转移至每个20微米的尼龙网滤器上，并用5至10毫升冰冻的MV-3溶液冲洗微血管。

使用镊子将每个滤膜转移至盛有冰冻 MV-3 溶液的独立烧杯中，轻轻振荡每个滤膜约 30 秒，以分离微血管。转移至 15 毫升锥形管后，通过离心收集微血管，并使用低吸附枪头将每个沉淀重悬于 1 毫升冰冻 MV-3 溶液中。然后，将小型脊椎动物样本中的微血管悬液转移至 1.7 毫升微量离心管中，在 4 摄氏度下以 20,000 × g 离心 5 分钟。

对于大型脊椎动物标本，将悬液转移至若干个5毫升离心管中，每管加入4毫升MV-3溶液，在4摄氏度、2,000 × g条件下离心5分钟。通过针对CD31、PDGFR-β和水通道蛋白4的免疫标记，可检测如上所述分离得到的微血管中神经血管单元的内在组分，包括皮层、小脑、垂体、下丘脑、脑干及脊髓微血管。同样，也可观察到黏附连接蛋白VE-钙黏蛋白、紧密连接蛋白CLDN5和闭锁小带蛋白-1（Zonula Occludens-1）、三细胞连接蛋白angulin-1，以及基底标志物趋化因子配体CXCL12和γ-谷氨酰转移酶-1的表达。

此外，大多数微血管缺乏α平滑肌肌动蛋白的表达，表明该分离方案可选择性地靶向小口径微血管。从其他小型无脑回脊椎动物（如鸟类、蜥蜴、青蛙和鱼类）获得的微血管具有一些共同的形态学特征，提示该方法有助于进一步表征不同物种间神经血管单元的差异。蛋白质表达变化的定量分析显示，在实验性自身免疫性脑脊髓炎高峰期，脊髓微血管上的血管细胞黏附分子1和连接黏附分子B表达增加。

然而，血管细胞黏附分子1在垂体微血管中也显著增加，而在下丘脑和脑干微血管中则减少。此外，在慢性实验性自身免疫性脑脊髓炎过程中，中枢神经系统所有组织中的血管细胞黏附分子1表达均出现变化，同时下丘脑和垂体微血管中的连接黏附分子B表达也发生变化。在此操作步骤完成后，可进行包括蛋白质印迹、PCR和免疫组织化学在内的定量分析，以揭示血脑屏障内基因和蛋白质表达模式的特征。

多聚甲醛是一种急性毒性试剂，操作时应始终在通风橱内进行，并穿戴适当的个人防护装备。