清醒小鼠中使用玻璃光导电极进行光遗传学鉴定神经元类型

该方法有助于解答神经科学领域中的关键问题，例如不同类型神经元的功能。该技术的主要优势在于，可以利用廉价且易得的材料，在活体动物中可靠地识别不同类型的神经元。我将与我们的技术员村本真司（Shinji Muramoto）以及本实验室的助理教授马兰兰（Lanlan Ma）共同演示该实验流程。

开始此操作时，轻轻将用于压力控制的钢管从持针器的筒体中抽出。通过钻孔扩大持针器筒体上针座侧的孔。然后，将一根不锈钢管放入该孔中。

接着，将一个用于直径为2.5毫米插芯的陶瓷分体对接套筒插入孔中。在L形兔头支架上钻一个孔，并用环氧粘合剂将电极 holder 的 barrel 部分固定到兔头支架上。随后，用螺丝将其固定至操纵器上。

使用铣刀将柱状电路板间隔件加工成矩形块状，制备定制的头固定柱，并用锯片将其切割成两个头固定柱。然后，使用铣刀将头固定柱的底部修平。手术前，使用高压灭菌器对所有手术器械和一个头固定柱进行灭菌处理。

用70%酒精清洁立体定位仪框架和加热垫。接着，麻醉小鼠并将其置于加热垫上的立体定位仪框架中。本实验使用一种转基因小鼠，其表达通道视紫红质-II的抑制性神经元。

将牙齿放入咬杆的孔洞中，轻轻固定鼻夹。随后，使用耳杆固定头部两侧。当耳杆正确固定头部后，进一步拧紧鼻夹。

将眼膏涂抹于眼睛。使用小剪刀修剪头部的毛发，并用浸有氯己定葡萄糖酸盐的棉签清洁头皮。然后沿中线切开头皮并将其拨至两侧。

用浸有70%酒精的棉签去除骨膜，并让颅骨干燥。然后，将头固定装置连接到操纵器上。使用操纵器将头固定装置平放在颅骨上，位置围绕前囟。

在冰箱中预冷的小培养皿中，加入四滴单体、一滴催化剂和一小勺聚合物，混合均匀。将牙科水泥涂抹在额骨和顶骨上，将头固定装置固定于颅骨。待牙科水泥硬化后，将小鼠从立体定位仪中取出。

在暴露的皮肤上涂抹抗生素软膏，并注射美托咪啶拮抗剂与抗生素的混合物。然后将小鼠置于带有加热垫的笼子中直至其苏醒，并将其放回含有丰富化设施的饲养笼中。为了在目标脑区进行记录而实施开颅手术，需使用浸有氯己定葡萄糖酸盐和70%酒精的棉签清洁颅骨。

使用牙科钻头仔细刮除记录位点上方的颅骨。当骨质足够薄时，用手术刀尖将其切开并移除。然后在暴露区域周围涂抹牙科水泥，以增强颅骨强度。

待牙科水泥硬化后，用硅胶粘合剂覆盖暴露的脑区。然后将动物置于笼子中的加热垫上，直至其苏醒，并将其放回饲养笼中。在进行电生理记录之前，需让动物在开颅术后至少恢复一天。

在进行电生理记录之前，使用电极拉制仪将硼硅酸盐玻璃毛细管拉制成若干玻璃微电极。用10毫摩尔磷酸盐缓冲液（PBS）填充微电极。在某些记录中，向10毫摩尔PBS中加入2%神经生物素。

接下来，将动物放入记录室中。将一支装满液体的玻璃微量移液管连接到自制的光导探针固定装置上。将一根涂有氯化银的导线插入玻璃微量移液管中。

随后，将引线连接至记录放大器的前置放大头级。接着，将带有氧化锆陶瓷插芯的光纤跳线连接到光探针固定器的分体式对接套筒上。推动跳线插入套筒，直至陶瓷插芯的末端与玻璃移液管的后端接触。

补光线缆将来自LED的光传递至目标区域，该LED由单通道LED驱动器控制。随后，移除覆盖在颅骨开窗部位的硅胶粘合剂。在记录过程中，需定期将温热的生理盐水涂抹于脑表面，以防止脑表面干燥。

如有必要，使用尖头镊子去除硬脑膜。此处记录的是清醒状态下的VGAT通道视紫红质-II小鼠下丘中的峰电位反应。在VGAT通道视紫红质-II小鼠的下丘中，GABA能神经元特异性表达通道视紫红质-II。

在清醒小鼠中，当给予光刺激时，GABA能神经元和谷氨酸能神经元分别被兴奋或抑制。当光刺激通过玻璃电极传递时，会诱发某些神经元产生动作电位反应。相反，在其他神经元中，光刺激会抑制由声音刺激诱发的动作电位反应。

这些结果表明，玻璃光敏电极能够记录到分离良好的单个神经元活动，并可通过光刺激可靠地激活所记录的神经元。该技术的发展为神经科学领域的研究人员探索不同类型神经元在大脑不同区域神经回路中的功能奠定了基础。