基于生物素的下拉实验验证细胞miRNA的mRNA靶标

该方法可帮助我们解答mRNA生物学领域的关键问题，例如，通过计算机预测的mRNA靶标是否能够与特定的细胞microRNA直接相互作用。该方法的主要优势在于利用生物素标记的模拟物来富集目标mRNA。这些生物素标记的模拟物含有锁核酸（LNA）化学修饰的模拟结构，有助于形成非常稳定的寡核苷酸，具有极高的亲和力，从而增强反应的特异性。

该方法学的意义在于，它能够从理解微小RNA（microRNA）的生物学功能延伸至基于微小RNA的治疗策略。这主要是因为众所周知，微小RNA在细胞生物学的各个方面均发挥着关键作用。因此，通过鉴定微小RNA的靶标（即mRNA），我们无疑能够提供对发现新疗法和开发治疗手段至关重要的知识。

本实验方案由本实验室的研究生 Sabyasachi Dash 演示。为用链霉亲和素包被磁珠，首先将磁珠充分涡旋振荡以重悬。然后，取 30 µL 重悬的磁珠转移至一个 2 mm 无核酸酶的微量离心管中。

将装有磁珠悬浮液的离心管置于磁铁上静置两分钟。两分钟后，当磁珠被吸附至离心管与磁铁接触的一侧时，用微量移液器吸去上清液。随后，向磁珠中加入100 µL洗涤缓冲液。

加入洗涤缓冲液后，将试管从磁铁上取下。然后涡旋振荡珠子15秒以进行洗涤。接着，将含有磁珠的试管放回磁铁上静置两分钟。

孵育结束后，用移液器吸出上清液并弃去。然后，向磁珠中加入 100 µL 无 RNase 溶液。涡旋振荡磁珠 15 秒，以混匀 RNase 溶液。

然后，将珠子在室温下孵育5分钟。孵育5分钟后，将含有磁珠的离心管置于磁力架上静置2分钟。孵育结束后，用移液器吸出上清液并弃去。

接下来，向珠子中加入100微升重悬液，涡旋振荡15秒。振荡后，将离心管在室温下孵育5分钟。5分钟后，将含有磁珠的离心管置于磁铁上，静置2分钟。

两分钟后，用移液器吸出上清液并弃去。接着，向珠子中加入200微升封闭液。为使珠子在封闭液中重悬，需在室温下充分涡旋振荡15秒。

然后，将离心管置于4°C的多管旋转仪上孵育16小时。为制备裂解液，在超净台中使用细胞刮刀刮取转染的HEK293T细胞。随后，将细胞悬液转移至2毫升微量离心管中。

接下来，将细胞悬液在1,500g条件下离心5分钟。离心后，用pH 7.2的1×磷酸盐缓冲液重悬细胞沉淀。重复离心步骤，以获得无残留培养基的细胞沉淀。

离心结束后，迅速将沉淀置于冰上。接着，配制新鲜的细胞裂解缓冲液。缓冲液配制完成后，向微量离心管中的样品加入 260 µL 完全细胞裂解缓冲液。

用移液器反复吹打细胞沉淀，以获得均匀的悬浮液。为了裂解细胞，将离心管置于80摄氏度下孵育10至15分钟。然后将细胞置于冰上。

在台式离心机中，于 4°C 条件下以 16,000g 离心五分钟，重复此离心步骤。离心后，将含有裂解液的上清转移至冰上预冷的无菌 1.7 毫升微量离心管中，并弃去沉淀。向上清中加入 5 摩尔的氯化钠，使其终浓度达到 1 摩尔。

首先，配制下拉洗涤缓冲液。磁珠封闭过夜孵育后，将含有磁珠的离心管置于磁力架上静置两分钟。孵育结束后弃去上清液。

向珠子中加入 150 µL 冰冷的下拉洗涤缓冲液。然后在室温下涡旋振荡珠子 15 秒，随后立即在室温下孵育 30 至 60 秒。

静置一分钟后，将含有磁珠的离心管置于磁力架上两分钟。孵育结束后弃去上清液。随后，将磁珠重悬于300 µL的完整免疫沉淀洗涤缓冲液中。

加入氯化钠后，将300微升细胞裂解液转移至含有300微升磁珠的微量离心管中。然后在室温下将混合物置于摇摆混合器上孵育一小时。一小时后，将试管置于磁力架上静置五分钟。

孵育结束后弃去上清液。随后，向珠子中加入300微升预冷的完整沉淀洗涤缓冲液。加入缓冲液后，在室温下涡旋振荡珠子15秒。

然后将离心管置于磁力架上静置5分钟。孵育结束后弃去上清液。随后，将磁珠溶解于100 µL无核酸酶的水中，并置于冰上保存。

从磁珠中分离总RNA。然后，将分离得到的RNA溶解于25微升无核酸酶的水中。接着，使用分光光度计测定RNA的浓度。

最后，配制浓度为 50 纳克/微升的 RNA 工作液。接着，取 50 纳克总分离 RNA，按照制造商说明书合成互补 DNA。然后，加入寡核苷酸引物，使终体积为 20 微升。

将PCR管放入热循环仪中并启动程序。qPCR完成后，将每个孔中的PCR反应混合物转移9微升至新板的对应孔中。向每个孔中加入1微升互补DNA，使最终体积达到10微升。

接下来，使用耐热的PCR板封膜密封PCR板，并将其放入热循环仪中。然后，启动热循环仪程序。为了验证miR-125b的作用靶点，检测PARP-1和p53的靶mRNA表达水平。

有趣的是，PARP-1 和 p53 mRNA 的表达水平相较于作为阴性对照的肌动蛋白（Actin）mRNA 更高。实验中使用的其他阴性对照包括无模板对照以及三条带有3'端生物素标记的随机序列。此外，对 PARP-1 和 p53 的3'非翻译区进行定量，也显示出不同水平的扩增。

这与阴性对照（如肌动蛋白、无模板以及3'端生物素标记的随机序列）相比具有明显差异。PARP-1和p53的扩增表明，它们是细胞内miR-125b的强效靶点。一旦掌握，该技术从细胞接种、转染生物素标记的LNA模拟物，到最终完成PCR分析，若操作得当，可在一周内完成。

观看本视频后，您应能够充分理解如何在哺乳动物细胞中验证假定的 mRNA 靶标。通过在哺乳动物细胞中转染带有3'端生物素标记的锁核酸类似物，可实现高特异性且低背景噪声的验证效果。请务必注意，操作RNA（尤其是microRNA等小RNA）时极为敏感，容易发生降解。

因此，在进行该检测时应采取必要的预防措施，例如使用无核酸酶的水、无核酸酶的微量离心管和无菌缓冲液，并建议使用新鲜配制的缓冲液和试剂，以获得更高的灵敏度和更理想的结果。