长链非编码RNA靶标RNA的RNA下拉实验操作流程

本实验的总体目标是在培养的细胞或组织中鉴定出与特定长链非编码 RNA 相互作用的 RNA 分子伴侣。该方法通过提供长链非编码 RNA 调控 RNA 的新重要信息，有助于解析长链非编码 RNA 的生物学功能。该方法的主要优势在于其具有广泛的适用性，因为我们已对该方法进行了优化：首先针对多种长链非编码 RNA，其次适用于培养细胞和组织提取物。

我们的方法基于两种先前方法的结合：即染色质RNA纯化分离法（ChIRP，Chromatin Isolation by RNA Purifications）和RNA靶标捕获杂交分析法（CHART，Capture Hybridization Analysis of RNA Targets）。本方法的特异性在于，寡核苷酸探针是通过生物信息学建模设计的，该模型针对长链非编码RNA的二级结构，旨在识别其RNA靶标。本次实验操作将由我团队的两名技术人员Benedicte Boyer和Severine Guillen进行演示。

按照文本方案培养GH4C1细胞后，从细胞培养板中移除培养基，并用一份体积的PBS洗涤细胞。加入10毫升含1%PFA的PBS以固定细胞。随后，在室温下振荡条件下对细胞进行交联，持续10分钟。

加入1毫升1.25摩尔的甘氨酸以终止PFA的作用，并在室温下振荡样品5分钟。然后通过抽吸弃去溶液，用10毫升PBS洗涤细胞两次，每次5分钟。接着加入1毫升PBS，用细胞刮刀收集细胞，并转移至离心管中。

将样品在 510 g 和 4 摄氏度条件下离心 5 分钟。然后，尽可能吸除上清液，并将沉淀物在 -80 摄氏度条件下长期保存。为进行组织交联，将 5 毫克新鲜获取的小鼠垂体组织浸入 10 倍体积的含 1% PFA 的 PBS 溶液中，在室温下振荡处理 10 分钟。

通过加入 0.05 毫升 1.25 摩尔的甘氨酸溶液终止 PFA 反应，并在室温下振荡组织 5 分钟。吸除液体，用 0.5 毫升 PBS 洗涤组织两次。尽可能去除上清液后，将交联的组织在 -80 摄氏度长期保存。

配制裂解缓冲液，随后直接用于裂解样品，无需预先解冻。每100毫克细胞沉淀或组织使用约1毫升缓冲液进行重悬。将裂解后的样品置于4°C水浴中，并根据文本方案优化的条件开始超声处理程序。

超声处理后立即在 12,000 g 和 4 °C 条件下离心样品 5 分钟。然后将上清液转移至新的离心管中。超声处理的条件必须优化，以确保足以降低 DNA 带来的黏度，同时避免产生其他片段化的 RNA。

对超声处理的样品进行杂交时，向各管中加入两倍体积的杂交缓冲液并涡旋混匀。将每个样品中的20微升转移至离心管中，在负20摄氏度保存。向每个样品中加入100皮摩尔的生物素化寡核苷酸探针。

然后，在室温下将样品置于试管旋转仪上，以中等振荡速度孵育4至6小时。孵育结束后，向样品中加入50 µL磁性链霉亲和素珠，同时加入终浓度为200单位/毫升的RNase抑制剂溶液以及终浓度为5 µL/毫升的蛋白酶抑制剂混合物。将试管置于试管旋转仪上，室温下中等振荡条件下孵育过夜。

第二天，将离心管置于磁力架上，弃去上清液，进行RNA提取。然后向磁珠中加入900微升洗涤缓冲液，将离心管在室温下置于旋转器上孵育5分钟。接着将样品置于磁力架上，弃去缓冲液，并重复洗涤五次。

除去最后一次洗涤液后，向样品中加入 95 微升蛋白酶 K 缓冲液和 5 微升浓度为 20 毫克/毫升的蛋白酶 K。随后，将输入样品在冰上解冻，并加入 75 微升蛋白酶 K 缓冲液和 5 微升蛋白酶 K。将样品在 50 摄氏度孵育 45 分钟，然后在 95 摄氏度孵育 10 分钟。

将样品置于冰上冷却三分钟，然后置于磁力架上，收集含有RNA的上清液，并弃去磁珠。使用RNA纯化试剂盒对RNA进行纯化。最后，将RNA于-80摄氏度保存，并根据文本方案进行逆转录（RT）和定量PCR（qPCR），以及构建DNA文库。

根据此处所示的lncRNA二级结构的生物信息学建模，设计了针对两种lncRNA（大鼠Neat1或Malat1）的探针，用于GH4C1培养细胞以及小鼠Neat1的垂体组织提取物。相对于输入样本，计算了非特异性和特异性探针在Neat1或Malat1上的相对富集度。该图展示了特异性探针在大鼠GH4C1垂体细胞系及小鼠垂体组织提取物中富集Neat1的效率。

当针对特定寡核苷酸或SO探针的实验方案靶向Malat1时，生成了一个高效的探针和一个效率较低的探针，后者被弃用。在进行RNA下拉实验和RT qPCR后发现，与GH4C1细胞提取物中Neat1结合的RNA，同样也存在于垂体组织提取物的Neat1结合RNA中。事实上，在Neat1 RNA下拉实验后，Malat1在GH4C1细胞系以及小鼠垂体组织提取物中均被证实为Neat1的靶标。

此外，在GH4C1细胞中使用探针进行Malat1 RNA下拉实验后，Neat1显著富集。这两种lncRNA之间存在的密切关系与Neat1和Malat1可能的共调控作用一致，这一点在Malat1基因敲除小鼠中Neat1 RNA表达发生变化的研究中已有提示。一旦掌握该技术，可在两到三天内实现对目标长链非编码RNA的RNA靶标的捕获。

采用生物信息学方法时，设计多个反义探针并通过实验比较其效率至关重要，因为探针效率可能受到细胞裂解液制备过程的影响。通过该流程，可进行高通量RNA测序，从而获得目标长链非编码RNA的全部RNA相互作用组。观看本视频后，您应能够充分理解如何利用高效且特异的探针捕获长链非编码RNA的RNA结合伙伴，这些探针基于生物信息学对长链非编码RNA二级结构的建模分析，靶向其可及区域进行杂交。