外周相关蛋白在质膜上的分配测定

该方法有助于解答细胞生物学中的关键问题，包括解析细胞信号通路。该技术的主要优势在于，实际上无需任何复杂的显微技术。此外，该方法速度非常快，因此可用于实时观察细胞内蛋白质的分布。

由于光衍射会导致显微镜下质膜与细胞质荧光发生混合，因此对外周结合蛋白在膜上的分布进行评估和定量较为复杂。本实验步骤首先按照文本方案中所述准备生物材料，随后使用FM 4-64染料对制备好的材料进行染色，染色方案应根据所研究的材料选择适宜的方法。

对于烟草BY-2细胞，将200微升细胞悬浮液与0.2微升溶于二甲基亚砜的10毫摩尔FM 4-64溶液染色。为获取每个细胞的一个赤道面共聚焦切片，需设置针对用作蛋白标签的发色团和FM 4-64的顺序双通道扫描，并设定更高的光学分辨率。

一个示例配置是使用数值孔径为 1.3 的 63 倍油镜物镜，成像尺寸为 1,024 × 1,024 像素。安装 Fiji ImageJ 发行版及所需的宏外设。在 Fiji 中，从主菜单选择“插件”，然后选择“宏”，再选择“安装”，并指定下载的 ImageJ 宏外设文件的路径。

安装 R 项目软件及所需包。运行 R 图形用户界面，在主菜单中选择包，然后安装包，并指定最近的仓库以及要安装的包 ggplot2。下载 R 包 peripheral。

通过选择软件包，然后从本地文件安装软件包来完成安装。处理细胞质标记物的共聚焦图像。具体操作为：使用 Fiji 软件中的插件功能，依次选择 Bio-Formats，然后在 Fiji 菜单中使用 Bio-Formats 导入器，并采用默认设置导入图像。

运行分析设置的导入选项宏。通过单击菜单工具“外周蛋白菜单”后选择相同项目来激活该宏。在“高斯模糊半径像素”字段中定义适当的值。

这会影响图像平滑和噪声降低。较低的值已足够，且不会导致任何图像信息丢失。现在在轮廓线宽度像素字段中设置一个值。

较粗的线条会导致轮廓曲线的平滑程度更高。建议使用默认值10像素。根据样本分隔符和导出项目的定义设置图像标题。

单击“确定”。在下一个对话框中检查标题解析结果，然后单击“确定”或“返回”以重置。接下来，在处理后的图像中对细胞质膜区域进行线性选择，并测量荧光分布。为此，请从 Fiji 工具栏中选择 Fiji 工具的直线工具。

点击图像并在质膜区域上拖动一条线。该线必须从细胞外空间开始，且应垂直于质膜。选择皮层胞质层较厚且更均匀的区域。

线性选择的最佳长度为5到10微米。通过点击Fiji工具栏中的“获取轮廓”工具来运行获取轮廓宏。系统将自动测量两个通道中的荧光轮廓，并在结果窗口中显示数据。

根据各个信号的变异性，为每种细胞选取具有代表性的轮廓数量。运行“绘图轮廓数据”宏，以图形化方式可视化所测得的轮廓。在弹出的宏对话框中设置参数。

请勿选中“对输入数据使用筛选”复选框。通过点击相应的单选按钮，指定绘图是基于结果窗口中单个 CSV 文件的最新数据生成，还是基于指定目录中所有 CSV 文件的数据生成。通过选中相应的复选框，指定用于绘图的分组因素。

如果希望在独立的图表中显示所有曲线，请选择因子 I。如果希望将所有数据绘制在同一张图中，请保持复选框未选中状态。单击“确定”。在下一个对话框中指定保存结果的路径和文件名，或用于后续数据导入。

通过单击对话框中的“确定”按钮确认分析，以显示已执行的 R 代码。如果某些绘制的曲线在细胞外或细胞内空间存在过强信号，请运行轮廓过滤设置宏。随后，在弹出的宏对话框中设置相应参数。

针对每个通道，在文件中设置适当的强度阈值，并移除具有过强细胞外或细胞内信号的测量数据。在“X 坐标小于或大于”字段中指定将应用强度阈值的区域，然后点击“确定”。再次运行“绘制轮廓数据”宏，选中“使用过滤进行数据输入”复选框。随后，添加之前保存的文件中的数据。

确保所有异常轮廓均已成功移除，否则需优化过滤参数。运行“创建模型”宏，基于校准数据建立质膜和细胞质荧光分布的模型。在调用的宏对话框中，根据文本方案详细设置参数后，点击“确定”。在接下来的对话框中指定输入文件的路径和名称，并在显示所执行 R 代码的对话框中点击“确定”以确认分析。

接下来，处理表达目标蛋白的细胞图像。导入图像并按之前的方法设置分析参数。平滑程度和线条宽度应保持一致。

继续测量轮廓。通过绘图检查轮廓的准确性，并根据需要按照前述方法设置滤波。运行计算分布宏，以计算蛋白质在质膜与细胞质之间的分布情况。

指定输入数据和模型来源，并可选择设置数据过滤。若需对结果进行过滤，请保持复选框处于激活状态，以去除残差变异性大于设定阈值的结果。指定个体剖面测量信号分解无法解释的最大允许残差变异性的阈值。

选择可用于创建箱线图的样本分组因素。单击“确定”，指定输入或输出路径，然后在显示所执行 R 代码的对话框窗口中再次单击“确定”以确认分析。图中显示的是一个经 FM 4-64 染色的细胞，该细胞表达一种植物蛋白，该蛋白通过N-豆蔻酰化及与磷脂酰肌醇的静电相互作用定位于质膜。

这些相互作用通过渥曼青霉素进行实验性干扰。通过将第二个氨基酸位置的甘氨酸位点（作为N-豆蔻酰化位点）进行突变，以检测N-豆蔻酰化的重要性。通过截除蛋白的N端结构域，检测同时去除两种质膜结合能力的影响。

结果中的箱线图显示，在N端肉豆蔻酰化位点突变以及药物处理后，质膜亲和力下降。这两种处理的联合效应与去除N端结构域的效果相当。观看本视频后，您应能够充分理解如何按正确顺序执行分析的主要步骤，以及如何设置相应的参数。

完成此分析后，可采用方差分析（ANOVA）等统计方法对所获得的数据进行统计学评估。尽管该方法最初是为植物悬浮细胞开发的，但也可应用于其他具有光滑且质膜界限清晰可辨的细胞或组织。