用于膜蛋白-蛋白相互作用分析的天然细胞膜纳米颗粒系统

本方案将帮助研究人员利用天然细胞膜纳米颗粒系统结合电子显微镜技术，更准确地确定膜蛋白的天然寡聚状态。该技术的优势在于能够在类似天然细胞膜的环境中提供膜蛋白的精确结构数据，并可用于未来的高分辨率结构解析。本实验操作将由本实验室的博士后研究员 Kyle Kroeck 演示。

为了制备天然细胞膜纳米颗粒，将一克目标膜沉淀物重悬于10毫升NCMN缓冲液A中。使用玻璃Dounce匀浆器在20°C下对重悬的细胞膜样品进行匀浆，并将悬浮样品转移至一个50毫升聚丙烯管中。向样品中加入膜活性聚合物储备液和额外的NCMN缓冲液A，使膜活性聚合物的终浓度达到2.5%，并在20°C下振荡反应两小时。孵育结束后，对样品进行超速离心。

离心过程中，用25毫升NCMN缓冲液A平衡5毫升镍NTA柱。离心结束后，将上清液转移至柱上，并使用设定为0.5毫升/分钟流速的注射泵，在20摄氏度条件下将上清液加载到柱上。用足量的NCMN缓冲液B冲洗快速蛋白液相色谱仪管路，彻底清洗系统后，将柱连接至色谱仪。以1毫升/分钟的流速用30毫升NCMN缓冲液B洗涤柱，并收集穿流液。

用30毫升NCMN缓冲液C以1毫升/分钟的流速洗涤层析柱，并收集穿流液。用20毫升NCMN缓冲液D以0.5毫升/分钟的流速洗脱蛋白，使用馏分收集器收集每管1毫升的样品馏分，然后将蛋白样品置于4°C保存，并通过SDS-PAGE检测与快速蛋白液相色谱洗脱图谱中观察到的峰相对应的样品。制备负染电镜载网时，将滤纸包裹在玻璃载片上，使碳膜面朝上，然后将用于样品制备的载网放置在载片上。

将带有透射电镜载网的玻片放入辉光放电仪的两个电极之间的腔室内，盖上玻璃盖，确保盖子居中且密封良好。启动辉光放电仪，并确认可见由等离子体产生的紫色光。仪器运行结束后，等待腔室恢复至大气压，再打开玻璃盖，将玻片取出并放置于实验台面上。

将纯化后的蛋白质样品浓度调整至约 0.1 毫克/毫升，并取 3.5 微升蛋白质样品滴加到厚度为 10 纳米的碳支持膜载网上。孵育 1 分钟后，用滤纸从透射电镜载网表面吸去液体，并用 3 微升水滴洗涤载网表面 3 次，每次使用一滴。最后一次水洗后，再用 3 微升新鲜过滤的 2% 醋酸铀溶液滴洗载网表面 2 次，每次使用一滴。

最后一次醋酸铀洗涤后，用3微升新鲜过滤的2%醋酸铀液滴对载网染色1分钟。孵育结束后，使用新的滤纸条吸去液滴，并将载网在空气中干燥至少1分钟，然后存放在载网盒中以备后续使用。此处可观察到如图所示通过透射电子显微镜获得的负染图像。

通过去垢剂纯化的野生型Acraflavin抗性通道蛋白B样品的负染图像显示，该溶液为均一的单一分散颗粒，蛋白呈现出结构清晰的三聚体四级结构。这些三聚体结构与纯化后观察到的尺寸排阻色谱结果一致。相比之下，同样使用去垢剂纯化的P223G突变体的负染图像中，则呈现出异质性的多分散纳米颗粒溶液，具有聚集倾向，但未观察到明显的天然三聚体结构。

这些结果也得到了尺寸排阻色谱的支持。在使用膜活性聚合物 NCMNP11 进行纯化后，野生型和突变型蛋白表现出相似的结果。使用 NCMNP52 聚合物可促进生成尺寸大得多的天然细胞膜纳米颗粒，从而能够在单个天然细胞膜颗粒中对多个阿克拉弗林耐药通道蛋白 B 三聚体进行成像。

然而，在突变体样品中，即使观察较大的天然细胞膜双层区域，也未观察到三聚体颗粒。对纯化蛋白样品进行SDS-PAGE分析，证实所有样品中均存在AcrB耐药蛋白，纯度超过95%，且分子量与预测值一致。当将本方案应用于其他蛋白时，需通过实验确定合适的膜组分用量，以及溶解过程的时间、时长和温度。

如果样品的图像显示出具有明确结构单元的均一单分散颗粒溶液，则该样品可用于冷冻电子显微镜的高分辨率结构测定。