利用斑马鱼胰岛单细胞分辨率钙成像分析β细胞功能

该方法有助于理解β细胞领域中的重要问题，例如胰岛内单个β细胞之间的功能异质性。该技术的主要优势在于，通过对β细胞进行活体成像，可提供高时空分辨率。

我们可以捕获单个β细胞内的钙振荡。根据文本方案将一条鱼实施安乐死后，将其转移至含有钙和镁的HBSS溶液的培养皿中。然后在配备荧光灯和红色滤光镜组的体视显微镜下，使用锋利的镊子从口部向肛门鳍方向剪开皮肤。

剥离右侧的切口皮肤以暴露腹腔，从而显露内部器官。然后利用红色荧光识别β细胞中的mKO2表达，定位胰岛。通过仔细去除周围组织（如肝脏和脂肪细胞），清洁原代胰岛。

注意避免损伤或戳破胰岛。接下来，用移液器将30 µL的HBSS液滴滴加到玻璃底培养皿的中央，然后将分离的胰岛转移至液滴中。

用HBSS小心清洗胰岛一次，然后用30微升纤维蛋白原工作液清洗一次。清洗过程中避免胰岛干燥，以免导致细胞死亡。缓慢而轻柔地向胰岛中加入10微升浓度为10单位/毫升的凝血酶溶液。

将胰岛和培养皿静置15至20分钟，不要触碰。观察纤维蛋白原-凝血酶液滴逐渐变得黏稠且稳定。需给予足够时间，使凝血酶在纤维蛋白原溶液中充分聚合。

否则在成像过程中模具将无法提供稳定性。为进行GCaMP荧光的离体活体成像，先在模具上加入200 µL HBSS，然后小心地将培养皿放置在共聚焦显微镜的载物台支架上。接着使用20倍、0.8 NA的物镜并启用明场模式，定位胰岛。

使用红色荧光滤光片观察β细胞中核定位的mKO2荧光，聚焦于胰岛。单个细胞核应清晰可见。通过手动沿Z轴方向移动穿过胰岛的厚度，找到清晰的成像平面。

确保成像平面包含 50 至 100 个β细胞用于成像，且细胞核内 mKO2 荧光亮度均匀，尤其是在胰岛中心区域。接下来，在智能设置菜单中，按照以下参数为 GCaMP6 和 mKO2 荧光设置顺序采集。对于 GCaMP6，选择 488 纳米的激发光，发射光波长范围约为 500 至 555 纳米。

在伪彩中选择 GFP。对于 mKO2，选择 561 纳米的激发光和 570 至 630 纳米的发射光。伪彩选择 mCherry。

在采集模式下，将图像分辨率设置为 1,024 × 1,024 像素，扫描速度设为 10，平均次数设为 1。选择时间序列选项，设置持续时间为 500 个循环，每帧采集时间约为 2 秒，以启动连续记录。密切观察成像循环过程。

在前50帧不干扰图像采集后，轻轻将5微升200毫摩尔的D-葡萄糖溶液滴加到承载胰岛的凝胶表面。随后在10毫摩尔葡萄糖条件下采集150帧图像。时间序列的前50帧对应β细胞在5毫摩尔葡萄糖条件下的活性。

这是基础活性。响应性的β细胞会随时间推移显示出绿色荧光的逐渐增强和减弱。在第200帧时，通过轻轻加入10微升200毫摩尔的D-葡萄糖，将葡萄糖浓度提高至20毫摩尔。

然后在 20 毫摩尔浓度下采集 150 帧图像。要在 FIJI 中打开图像文件，请选择插件（Plugin），LSM Toolbox，显示 LSM Toolbox。在 LSM Toolbox 中点击 Open LSM 并选择图像文件。

在“分析”菜单的“工具”下打开 ROI 管理器。使用工具栏中的多边形选择工具，手动绘制感兴趣区域（ROI）。在红色通道中绘制 ROI，使其覆盖大于细胞核的区域，以包含部分细胞的细胞质。

确保各帧之间的 ROI 位置保持一致，必要时调整其位置。通过单击“添加”按钮，将选定的 ROI 添加到 ROI 管理器中。选择并添加多个 ROI，以获取多个细胞的数据。

接下来，从“分析”菜单中选择“设置测量”。然后选择“积分密度”，以指定提取该区域内总的荧光强度。切换到包含 GCaMP 荧光的绿色通道，在 ROI 管理器中选择“多点测量”。

这将提供整个时间序列中细胞的强度测量值。将FIJI的输出结果保存为逗号分隔的文本文件。从LSM工具箱中获取图像帧的时间戳。

使用“应用图章”、“应用 t-图章”、“文件名”、“导出到文本文件”功能获取时间戳。通过“另存为”选项保存时间戳，或将其复制到电子表格中。在汇总所有细胞的强度值后，可逐个细胞进行分析，或自动完成分析。

更多细节请参见文字版实验方案。在本实验中，对来自45天斑马鱼龄（DPF）转基因品系的单个原代胰岛β细胞进行了刺激，该品系在β细胞中特异性表达核定位的mKO2和GCaMP6。实验中采用葡萄糖梯度刺激细胞，随后用氯化钾使其去极化，并对细胞的活动进行了分析。

使用 FIJI 和数据分析软件，提取并归一化了单个β细胞的 GCaMP6 荧光强度。从该荧光强度轨迹可见，当葡萄糖刺激时，单个β细胞表现出 GCaMP6 荧光的振荡，而加入氯化钾后荧光趋于稳定。该技术可提供β细胞对葡萄糖响应能力的细胞级分辨率，并揭示其功能特性。

一旦掌握，若操作正确，该技术可在45分钟内完成。在执行此操作过程中，重要的是要验证β细胞的活性。在此操作之后，可进行其他方法，如基因操作，以研究特定基因在β细胞功能中的作用。

观看本视频后，您应该能够很好地掌握如何测量单个β细胞内的葡萄糖反应。