细菌球状体和原生质体的制备与可视化以表征抗菌肽的定位

该方法有助于解答抗菌肽领域中的关键问题，即肽是否定位于细胞膜或穿越细胞膜。利用球状体和原生质体，可以在生理相关性较强的模型系统中实现对肽定位的可视化与分析，从而避免细菌细胞成像时所遇到的分辨率难题。尽管该方法可用于研究抗菌肽，也可应用于其他具有膜活性的物质，例如细胞穿透肽。

应在生物安全柜或层流罩中，采用适当的无菌技术制备革兰氏阴性大肠杆菌球状体和革兰氏阳性巨大芽孢杆菌原生质体。若需要，可使用含有抗生素抗性质粒的细菌菌株，并可在开放的实验台面上制备球状体和原生质体。本视频中，使用具有抗生素抗性的细菌菌株在开放实验台面上制备球状体和原生质体。

为制备过夜培养物，使用无菌移液器吸头将单个细菌菌落从固体琼脂培养板转移至含有两到三毫升3%胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）的14毫升培养管中，在37摄氏度下振荡培养16至21小时。为制备革兰氏阴性大肠杆菌（E.coli）原生质球，将过夜培养物按1:100比例稀释，并加入25毫升TSB至250毫升锥形瓶中，再将细菌放回振荡培养箱继续培养2.5小时。当溶液在600纳米处的光密度达到0.5至0.8时，将培养物按1:10比例稀释于新鲜TSB中，置于新的250毫升锥形瓶内，进行第二次2.5小时振荡培养，最终头孢氨苄（cephalexin）的有效浓度为每毫升60微克。

在1000倍光学显微镜下观察，制备长度约为50至150微米的单细胞丝状体。离心细菌溶液以收集丝状体，并倾去上清液。轻轻加入1毫升0.8摩尔蔗糖溶液洗涤丝状体，注意不要扰动沉淀。

一分钟后，弃去上清液，注意不要扰动沉淀，然后按相应顺序向纤维中加入指定的试剂。室温孵育十分钟后，在一分钟内逐渐加入一毫升溶液A，同时用手轻轻旋转混匀。室温孵育四分钟后，将纤维悬液均分为两等份，分别加入两个含有七毫升4°C溶液B的15毫升锥形管中。接下来，通过离心收集纤维沉淀，并使用巴斯德吸管小心吸除上清液，仅保留一至二毫升上清液，注意不要扰动沉淀。

使用 p1000 移液器轻轻重悬沉淀。通过光学显微镜检查样品的小份 aliquot，以确认原生质球的形成。原生质球可在 -20 摄氏度下保存长达一周，或直至经历三次冻融循环。

为了制备革兰氏阳性巨大芽孢杆菌（B. megaterium）原生质体，将过夜培养的细菌培养物按1:1000的比例稀释于250毫升锥形瓶中的100毫升含3% TSB的培养基中，在37摄氏度下振荡培养4.5小时。当液体培养物在600纳米处的光密度达到0.9至1.0时，将菌液分装至两个50毫升锥形管中进行离心，并使用移液器吸除上清液。每管沉淀用2.5毫升原生质体培养基重悬，然后将悬液合并至一个125毫升锥形瓶中继续培养。

向培养物中加入1 mL浓度为5 mg/mL的溶菌酶，在37°C下振荡孵育1小时。在光学显微镜下监测原生质体的生长情况，并记录任何异常现象，例如细菌呈现膨胀的杆状而非球形。孵育结束后，将悬浮液转移至15 mL锥形管中进行离心，并将沉淀重悬于5 mL原生质体培养基中。

原生质体可在零下20摄氏度保存长达一周，或直至经历三次冻融循环。为观察球状体或原生质体，取5微升目标悬浮液滴加至多聚-L-赖氨酸包被的玻片上，随后加入2微升FITC标记的100至200微摩尔抗菌肽（AMP）。在避光条件下孵育3分钟后，向样品中加入1微升合适的膜染料，再于暗处孵育3分钟。

孵育结束后，用盖玻片覆盖标记的球状体或原生质体，并用指甲油密封盖玻片。为观察细胞，打开共聚焦显微镜及相关激光器，选择63倍物镜，然后使用相应的成像软件获取8位、512×512的复合Z轴层扫图像，每层厚度为0.5 µm，覆盖每个目标细菌细胞的完整范围。为观察荧光标记抗菌肽（AMP）的定位情况，将复合Z轴层扫图像导入合适的图像分析程序，找到第一个目标球状体或原生质体最中心的切片。

在膜上放置一个直径为 0.3 微米的圆形感兴趣区域，一个位于细胞中心，另一个置于细胞外以测量背景荧光，注意避免饱和像素。软件可据此计算每个感兴趣区域的平均荧光强度。由于传统光学显微镜的分辨率限制，难以区分荧光标记的肽信号是来自细菌的膜还是胞内空间。

由于信号定位于细胞膜时会看似与胞内空间重叠。相比之下，与正常细菌相比，球状体和原生质体的体积增大，使得膜标记物与胞内空间之间呈现出清晰的分辨，从而更易于区分肽的定位。

例如，通过共聚焦荧光显微镜观察，可以可视化荧光标记的肽在大肠杆菌球状体（E.coli spheroplast）和巨大芽孢杆菌原生质体（B.megaterium protoplast）中的膜定位及其跨细胞膜的转位过程，如前所示。在球状体或原生质体的膜区域、胞内区域以及背景区域设置感兴趣区域，可计算每个与抗菌肽（AMP）相互作用的球状体或原生质体中胞内肽荧光强度与膜上肽荧光强度的比值。例如，该方法可用于观察组蛋白来源的微生物肽突变体与大肠杆菌球状体及巨大芽孢杆菌原生质体之间的相互作用。

在本实验中，AMP在两种细菌菌株中均表现出相似的定位模式，凸显其相对于野生型肽的转位能力降低。该技术最终使研究人员能够在单细胞水平上探究肽的定位模式。

为研究目标肽的作用机制提供见解。除了使研究人员能够收集更多图像以系统表征肽的作用机制外，较大球状体和原生质体的图像也比小型细菌细胞的图像更便于进行定量分析。